BLAST, giúp em với !

Chắc có sai sót gì đó, chứ đúng là nếu mồi của bạn có từ 20bp trở lên thì khó mà tìm thấy trình tự y hệt ở nhiều chỗ như thế. Tôi tò mò muốn biết bạn muốn khuyếch đại trình tự của gene gì vậy? và vị trí mồi của bạn ở đâu so với gene đó.
Tuy nhiên, nếu mồi đó không được thì bình tĩnh thiết kế mồi khác, đâu có gì mà phải lo lắng hoang mang dữ vậy? Ngay cả khi bạn đã thiết kế được một mồi theo bạn là tuyệt đẹp trên lý thuyết, order về chưa chắc đã chạy tốt nữa là. Một sư huynh của tôi đã từng nói với tôi là đừng quá tin tưởng mấy phần mềm thiết kế, nếu bối rối không chọn được cái tốt nhất thì cứ order hai ba cái về chạy thử để chọn lại... dĩ nhiên người sang trọng như sư huynh tui thì mới dám làm thế chứ cắc ké như tôi chưa từng dám mạnh tay như vậy. Nhưng chắc cũng có ngày order mồi về chạy hông được phải order cái khác thôi... thoải mái đi bạn ơi... blast thử vài cái mồi khác xem sao? vả lại tôi cũng không biết bạn chọn thế nào để được cái mồi "tốt nhất" theo bạn nói? Nếu là tôi, chỉ tiêu đánh giá mồi đầu tiên của tôi sẽ là blast, vì khi dùng phần mềm thiết kế thì thiệt ra các mồi nó đưa ra đều đã thoả mãn yêu cầu về Tm, %GC, độ dài, hairpin structure, dimer
Mong được tin thành công từ bạn

Theo những gì mình biết thì không nhất thiết đoạn mồi của bạn phải bắt cặp hoàn toàn với một đoạn khác mới bị unspecific band. Chỉ cần có tương đồng cao đặc biệt phía khởi đầu kéo dài là có thể "dính chưởng rồi".
Mình đã từng chạy PCR với mồi 26 nucleotides có 34% mismatched với template mà vẫn bắt cặp tốt (mục đích gây đột biến), dĩ nhiên là mình chạy trên plasmid.
Như vậy cái mồi của bạn cũng có khả năng bắt cặp với đoạn khác nếu mismatched<40%. Mà trên genomic thì khả năng này khá cao. Có lẽ bạn nên kéo dài thêm cái mồi của bạn, chắc bạn sợ hairpin khi kéo dài, nhưng mình đã từng chạy tốt với mồi bị hairpin (tuỳ kiểu hairpin).
Đây là cái mồi mình vẫn chạy thành công mà không gặp khó khăn nào (có nghĩa là ko khó khăn gì để cho nó bắt cặp mismatched), bạn có thể check với phần mềm thiết kế mồi của bạn.
5?T-GGTGAGcccgGtTGAatacGTTACTG-3'''' (lowcase are those mismatched)
hy vọng bạn sẽ thành công!
Được aigu sửa chữa / chuyển vào 04:53 ngày 03/10/2004

5'' - CCTTTGCCTGAGTTTTGCT -3''
Đấy, nó đấy, đoạn forward em thiết kế được đấy, cả một vùng có thể design được thì em lấy được cái trình tự này, nó đảm bảo được về rất nhiều điều khác ngoài yêu cầu đặt ra cho software. Thế nên em mới không muốn thay đổi nó.
Em thực sự muốn hỏi rằng: với đoạn nói trên, khả năng PCR bị kém đặc hiệu là như thế nào ạ ! Có nên dùng nó không ??
Còn bác nào bảo rằng với 20 nu hoặc hơn mà không tìm được những trình tự tương đồng trên genome thì đáng ngạc nhiên, chứng tỏ chưa thử với Blast. Em thì em thấy khoảng phải trên 30 mới đáng để khó tìm trình tự tương đồng.
Giúp em với nhé !

Theo common sense của mình thì mồi trên của bạn có vấn đề, và vấn đề nằm ở chỗ bạn có 2 đoạn RUN toàn T ở gần 2 đầu, nhất là cái TTTT gần đầu 3'''', theo tôi thì bạn sẽ bị mismatched nhiều chủ yếu do 2 cái đoạn RUN này (vì tương tác T-A yếu hơn G-C), đồng thời nucleotide cuối cùng (đầu 3'''') của bạn lại ko phải là G or C. Bạn thử kéo dài đầu 3'''' để có 1-2 G và/hoặc C đồng thời loại bớt ít nhất 1 đoạn RUN trong mồi của bạn. Khi thiết kế mồi thường mình cố gắng phải có 1-2 G/C ở đầu 3''''. Bạn thử kéo dài mồi (hơn 22 nu) để tăng Tm lên cũng có thể hạn chế được mismatched band.
Bạn cũng nên kiểm tra cùng với mồi reversed xem 2 mồi có bị Cross dimer ko nhé. Mình vẫn hay check lại mồi bằng Net Primer (http://www.premierbiosoft.com/netprimer/netprlaunch/netprlaunch.html).
+ TTTTGCT<=== Tương tác ở đầu 3'' của mồi của bạn rất yếu
+ Bạn thử kéo dài mồi về phía 5'' để có đầu 3'' là đoạn này xem nhé ==>XXXXXXXXXXX CCTTTGCCTGAG-3''
Được aigu sửa chữa / chuyển vào 12:33 ngày 04/10/2004

-------------------------------------------------------------------------------
RID: 1096871980-14031-172331508003.BLASTQ1
>gi|30721422|gb|AY271209.1| Homo sapiens clone SKG02-H01 putative promoter sequence
Length = 393
Score = 38.2 bits (19), Expect = 0.077
Identities = 19/19 (100%)
Strand = Plus / Plus

Query: 1 cctttgcctgagttttgct 19
|||||||||||||||||||
Sbjct: 196 cctttgcctgagttttgct 214
-----------------------------------------------------------------------------------
Tôi đã thử BLAST cái mồi của bạn và nhận được một trình tự đáng lưu ý ở trên. Tôi cho rằng trình tự mồi của bạn nằm ngay trong vùng promoter, như vậy việc bạn BLAST tìm ra được một đống trình tự nằm trên nhiều NST có trình tự y hệt trình tự mồi của bạn cũng không có gì lạ.
To aigu: bác phân tích mồi nghe chuyên nghiệp quá, chắc bữa nào tôi phải lãnh giáo bác vài chiêu. Cái link của bác sao tôi vào không được. Phần mềm netprimer này tôi đã nghe đến nhiều nhưng hình như tất cả những link tôi có hiện nay đều không thể vào được... sao vậy nhỉ???

gửi bạn Wei. . . Link của NET PRIMER: http://www.premierbiosoft.com/netprimer/netprlaunch/netprlaunch.html
Cái này chạy bằng Java applet nên bạn phải check xem cái IE của bạn có cho phép chạy java script ko đã (IE--> TOOL-->OPTION--> ADVANCE), ngoài ra khi vào đó lần đầu nó sẽ yêu cầu bạn cài môi trường (hình như là J2E gì đó) sau đó thì cửa sổ java applet sẽ hiện lên.
Bạn quá khen, mình chỉ nói theo common sense vì cũng chưa kiểm tra tài liệu (mà hình như mình cũng ko có tài liệu nào cả)

Nếu gene của bạn đã biết trình tự thì bạn đã thử dùng PRIMER3 để pickup chưa nhỉ?
http://www.justbio.com/primer/index.php
trường hợp này bạn vẫn phải check lại bằng BLAST xem khả năng mismatched với đoạn khác có cao không.

Em đang chỉnh sửa, tiện đây em hỏi luôn: Khi mình Blast, đối với trường hợp Plus/Plus thì ngon rồi, nhưng trường hợp Plus/Minus thì chẳng dùng làm gì cả. Vậy chương trình Blast đặt ra hai khả năng như thế để làm gì ???
Nếu dùng software để thiết kế ngon rồi, nhưng khi Blast thì rất tệ và ngược lại, vậy nên làm theo hướng nào ??
Việc tăng độ dài lên đối với em rất khó, vì đây là cặp primer em phải thiết kế sao cho có thể chạy đồng thời với 1 cặp primer (có target ở NST khác) (multiplex) vì vậy Tm chỉ có thể khoảng 56-58 thôi. Nếu tăng độ dài đòi hỏi phải chọn được đoạn có %AT cao, như thế rất khó thoả mãn yc .

DNA có hai mạch, mà trình tự trên gene bank chỉ có một mạch, nếu lỡ trình tự của bạn đưa vào chính là mạch bổ sung với mạch được lưu trên gene bank thì sao? lúc đó blast sẽ cho kết quả plus/minus.
Bạn có chắc là chọn mồi bằng tay thì kết quả BLAST sẽ tốt hơn chọn mồi bằng software không? vả lại chọn mồi bằng tay bạn phải chọn bao lâu để tính toán và chọn được mồi có Tm thích hợp, %GC tương đối, rồi còn hair pin, dimer, cross dimer.... ? không phải tự nhiên mà một phần mềm thiết kế mồi có giá chừng vài trăm USD mà vẫn có người mua??? (chẳng hạn primer premier, 885USD).
Nhiệt độ cho primer của bạn thuộc khoảng trung bình, không quá cao cũng không quá thấp, tôi nghĩ không quá khó để chọn được một mồi khác nằm trong khoảng nhiệt độ đó. Ðừng tăng độ dài để tăng độ đặc hiệu đối với mồi của bạn, hãy thử chọn mồi ở một vùng khác cách đó vài chục hoặc vài trăm base thử xem, nếu độ dài sản phẩm PCR của bạn không bị giới hạn quá nghiêm ngặt.
Về thiết kế mồi thì thú thiệt tôi đã xài qua khá nhiều chương trình, kết luận của tôi là mỗi chương trình có cách tính riêng nên kết quả mồi chả bao giờ giống nhau cả, tôi sẽ lấy mấy cái xịn nhất của mỗi chương trình đem blast để chọn ra cái có vẻ tốt nhất, tôi còn copy mồi của nhiều chương trình vào một cái để analyse coi cái nào tốt hơn về các chỉ tiêu đưa ra. Ðể coi, tôi đã xài primer express, vector NTI, primer premier, primer3 mà aigu đã nói, và một số trang web hỗ trợ thiết kế mồi như www.idtdna.com ... primer3 chọn mồi cũng khá tốt với nhiều chỉ tiêu, nhưng Tm của nó tính hơi cao hơn so với một số chương trình khác, nên nếu giới hạn Tm thì có lẽ sẽ bỏ qua một số mồi ngon. Vector NTI tôi thích chức năng thiết kế sequencing primer của nó. Primer premier có phần graph để xem Tm và %GC rất độc, phần đánh giá mồi có cho điểm rõ ràng nên đỡ rối loạn hơn mấy phần mềm kia. Primer express xài được có 1 lần cũng khá nhưng sau đó không biết sao hư mất không xài được nữa, phần viewer minh hoạ của nó dễ nhìn, nhưng phần analyse mồi thì tệ không đưa ra được đánh giá gì rõ ràng.
To aigu: cám ơn link của bạn, tôi vô được trang đó rồi, nhưng nó cứ bắt cài java bản cũ trong khi tôi có bản mới hơn sẵn nó lại cóc chịu xài. Nhưng tôi đã xài primer premier rồi mà lại không để ý là nó có thằng netprimer trên cùng trang, tôi nghĩ cùng cty làm ra chắc là giải thuật cũng tương tư, vả lại thằng primer premier là bản tính tiền chắc phải xin hơn netprimer nên thôi, không cần thử netprimer nữa. Dù sao cũng cám ơn bạn.

Ok, tất nhiên là em không thể dùng tay hoặc dùng bút dò dò trên cả mớ ATGC để tự design primer rồi. Em dùng Premier Primer 5.0 và nhận thấy đây là một software cực tốt và trực quan cho công việc của mình. Ngoài ra còn nhiều software khác em đã dùng thử (bản full chứ không phải trial) như Oligo 6.0, DNAman... và khoảng 3 đến 4 chương trình gắn sẵn trên website khác. Nhìn chung đều là những chương trình hay, option đa dạng.
Cho em hỏi một câu là ngoài Blast ra, có Fasta hay là gì đó em không nhớ tên có thể aligment đoạn hiện có với database. Anh giúp em giới thiệu vắn tắt vài dòng về nó được không ạ, để em lấy đà tìm hiểu..
Cám ơn anh trước ạ !