CÁC HỆ THỐNG ĐIỀU HÒA GENE ĐỘNG VẬT

CÁC HỆ THỐNG ĐIỀU HÒA GENE ĐỘNG VẬT

Khái niệm cơ bản về cái gọi là sự sống trên hành tinh chúng ta đã được mô tả từ rất lâu và rất ngằn gọn, đó là sự tăng trưởng thông qua các quá trình trao đổi chất; sinh sản; và khả năng đáp ứng với sự thay đổi môi trường nhờ các sự biến đổi bên trong. Mặc dừ khái niệm này đã được biết từ rất lâu, nhưng bản chất nội tai bên trong hay mức độ hiểu biết ở mức phân tử chỉ được mô tả chi tiết vào năm 1961 khi Jacob và Monod công bố đầu tiên về thuỷ tổ của các phản ứng đáp ứng với môi trường, lactose operone (xem thêm Hồ Huỳnh Thuỳ Dương, NXB GD 1997). Theo đó, E. coli có thể điều khiển trực tiếp con đường trao đổi chất của mình nhằm sử dụng lactose như là nguồn carbon cơ bản bằng cách ?omở?o bộ máy vận hành trao đổi lactose mà bộ máy này được mã hóa từ cái gọi là operone lactose (lac). Khi lactose không có trong môi trường lac sẽ bị các chất kiềm hãm (lacI) không cho hoạt động; chỉ khi có mặt của lactose thì các chất kiềm hãm mới rồi khỏi vị trí gắn kết để lac có thể dễ dàng phiên mã.

Ví dụ trên cho chúng ta có cái nhìn rất cơ bản về bộ máy điều hòa gene, nó bao gồm 3 yếu tố phân tử quan trọng:
- các phân tử dấu hiệu bên ngoài, trong ví dụ trên là đường lactose;
- các phân tử đóng vai trò thụ thể (receptor, trong vi dụ trên là LacI) làm cầu nối giữa các dấu hiệu phân tử với
- các trình tự hoạt hoá (operator sequence, ví dụ như lacO) theo cách thức phụ thuộc dấu hiệu rất đặc trưng.

Sự điều hòa gene đại diện cho một cơ chế phân tử quan trọng bật nhất và có tính chu kỳ của sinh vật nhằm đáp ứng với các biến đổi của môi trường. Ngoài ra còn có cơ chế điều hòa và đáp ứng tương tự cũng tham gia điều khiển những quá trình trao đổi chất ở VSV ví dụ như sự sản sinh kháng sinh, phát sinh bệnh lý. Ở eukaryote bậc cao, hệ thống điều hòa gene (cũng mang nhiều nét tương đồng với E.coli, sẽ nói chi tiết ở phần sau) đã phối hợp với các dấu hiệu môi trường, hormone, tiến trình trao đổi chất để tạo ra một hệ thống điều khiển có tính sống còn cho tế bào và cơ thể như là chu trình tế bào, cái chết được lập trình (apoptosis), phát triển. Qua đó cho thấy vai trò trung tâm của hệ thống điều hòa gene trong việc hoạt hóa và duy trì hoạt động sống của sinh vật, điều đó nói lên được tại sao nó đã thực sự thu hút sự quan tâm của các nhà nghiên cứu kể từ khi nó được khám phá năm 1961.

Nghiên cứu chi tiết mức độ phân tử hệ thống điều hòa gene liên quan mật thiết với một số con đường trao đổi chất phức tạp của tế bào động vật đã cho phép khám phá nhiều mối tương quan giữa hệ thống biểu hiện gene bất thường với những căn bệnh nghiêm trọng của người như bệnh ung thư, bệnh tự miễn dịch, hội chứng đột quỵ thần kinh. Tiếp theo đó, hệ thống điều hòa gene nhân tạo đã giúp đẩy nhanh và mạnh việc nghiên cứu hệ gene chức năng; hơn nữa hệ thống điều hòa gene cấp cao đã và đang trở thành công cụ quan trọng trong con đường nâng cao sức khỏe con người bằng liệu pháp gene:

(1)- Trong lĩnh vực sản xuất protein dược lý: việc sử dụng các kỹ thuật biểu hiện gene đã được điều hòa sẽ trở thành nền tảng cơ bản tiêu chuẩn để sản xuất các dòng protein dược lý có phổ biểu hiện khác nhau. Đến nay người ta đã sản xuất các tiền chất chữa bệnh bằng cách khai thác sự biểu hiện vượt mức của các gene trấn áp khối u; cũng như nâng cao hiệu xuất và chất lượng sản phẩm bằng cách điều khiển tốc độ tăng sinh của các dòng tế bào.

(2)- Trong liệu pháp kháng thể người ta cũng đã thành công khi sử dụng kỹ thuật biểu hiệu vượt mức có điều khiển đối với glycosyltransferase (β-(1,4)-N-acetylglucosaminyl-transferase III (GnIII) để sản xuất các kháng thể có gốc glycoform với tính ADCC được tăng cường khá mạnh (ADCC- antibody-dependent cellular cytotoxity- tạm dịch là tính gây độc của tế bào phụ thuộc kháng thể).

(3)- trong liệu pháp protein, người ta đã và đang tập trung sử dụng liệu pháp gene để sản sinh ra các protein trị liệu được sản xuất ngay trong cơ thể. Phương thức này rất tiện lợi cho phép thay thế các kiểu phân phối thuốc cổ điển ( uống, tiêm, ?). Khi biểu hiện in vivo, các protein liệu pháp sẽ cần được điều hòa về mặt dược lý để cho phép chuẩn độ các protein tuần hoàn ngay trong cơ thể. Nó còn cho phép điều khiển nồng độ protein liệu pháp trong cơ thể theo nhu cầu phác đồ điều trị hằng ngày. Kỹ thuật này đã ngày càng tối ưu hóa với một số protein như insulin.

(4)- trong liệu pháp tế bào và mô, người ta cần tái cấu trúc lại các hệ thống điều hòa trong tế bào như các con đường chuyển hóa hoặc sự tăng sinh, như vậy việc sử dụng các kỹ thuật điều khiển sự biểu hiện gene có điều kiện sẽ trở thành một công việc bình thường trong tương tai không xa.

(5)- trong việc nghiên cứu các bệnh người (như ung thư, tiểu đường, đột quỵ thần kinh?.), người ta thường dùng mô hình động vật knock-out để tìm hiểu cơ sở bệnh lý ở cấp độ gene của các bệnh này. Tuy nhiên các động vật knock-out có nhược điểm rất lớn là phần lớn gene gây bệnh khi biểu hiện có thể gây chết con vật ở giai đoạn phôi hay vừa mới sinh khiến cho việc xác định phenotype ở các giai đoạn sau của con vật rất khó khăn. Do vậy, các hệ thống điều hòa gene cho phép điều khiển sự biểu hiện các gene gây bệnh này ở bất kỳ giai đoạn phát triển nào của cơ thể, tùy theo mục đích nghiên cứu; nó còn cho phép tạo ra các dòng động vật chuyển gene khó nuôi và khó lai tạo.

Tuy nhiên, nhiều câu hỏi đặt ra là, tại sao mãi đến gần đây con người mới đạt được những thành quả như trên, tại sao kỹ thuật gene có vẻ phát triển chậm hơn so với các kỹ thuật khác? Một trong những rào cản đó là làm thế nào thiết kế được một hệ thống điều hòa gene dị thể mà khi biểu hiện nó sẽ gây ra sự xáo trộn tối thiểu đối với hệ thống điều hòa nội tại sẵn có trong tế bào. Trong vòng 2 thập kỷ qua, kỹ thuật điều hòa gene thật sự là một cuộc cách mạng trong nghiên cứu hệ gene chức năng. Một trong những kỹ thuậtthường dùng để tìm kiếm chức năng của một gene nào đó là gây đột biến điểm có định hướng rồi xem xét sự khác biệt về kiểu hình của tế bào nghiên cứu và tế bào đối chứng để suy luận. Tuy nhiên cần biết là khi gắn một đoạn DNA ngoại lai vào trong tế bào chủ, rất nhiều trường hợp xảy ra là vị trí này lại mang tính ngẫu nhiên, không theo định hướng ban đầu. Như vậy với các tế bào nghiên cứu, các kiểu hình thu được đôi khi có sự sai khác rất đáng kể so với tế bào đối chứng nhưng sự khác biệt này có thể do sự thay đổi có tính bù trừ hay do biến dị dòng gây ra chứ không phải do tác động trực tiếp của gene cần nghiên cứu gây ra. Sự thay đổi có tính bù trừ tức là hệ thống gene nội tại sẽ bật những gen tương ứng để hoạt động thay thế cho gene bị gây đột biến nhân tạo. Khái niệm biến dị dòng (clonal variation) là một khái niệm mới đặt ra dùng đề phân biệt các dòng tế bào hay cá thể có sự sai khác do quá trình tạo dòng gây nên chứ không phải nội tại bộ gene tạo ra như biến dị di truyền. Chính biến dị dòng này lại đôi khi cho ra kết quả suy luận chức năng gen nghiên cứu không đúng bản chất của nó. Trong trường hợp phân tích động vật chuyển gene, vấn đề còn phức tạp hơn do sự can thiệp của di truyền không có khả năng hồi biến khiến cho con vật có thể chết trong giai đoạn nào đó và vì vậy việc phân tích chức năng của gene rất khó khăn. Do vậy mà kỹ thuật điều hòa gene ở động vật có vú cho phép xác lập mối quan hệ gen-chức năng một cách chính xác cũng như chỉ định được các gene gây bệnh trên người từ đó xây dựng các phác đồ liệu pháp gene hiệu quả hơn.
Trong liệu pháp gene, người ta thường thiết kế một hệ thống điều hòa gene dị thể để khi đưa vào tế bào chủ, nó sẽ điều khiển gene đánh dấu mục tiêu theo yêu cầu của liệu pháp. Tiêu chuẩn hàng đầu để một hệ thống điều hoà này được áp dụng rộng rãi là nó phải cảm ứng ứng thuận nghịch, nhanh nhạy, chính xác, mạnh đối với các gene đánh dấu. Như vậy một hệ thống điều hòa gene lý tưởng sử dụng cho người phải thoả mãn các yêu cầu sau:

(1)- Tính đặc hiệu: hệ thống điều hòa này không được gây nhiễu hệ thống điều hóa nội tại sẵn có của tế bào chủ; và nó chỉ bị kích hoạt khi có sự hiện diện của các yếu tố cảm ứng không mang độc tính từ bên ngoài đưa vô, thường là thuốc. Với các dòng tế bào nuôi cấy, các yếu tố cảm ứng không gây độc có thể sử dụng là nhiệt độ, áp suất thuỷ tĩnh, nồng độ oxy,? nhưng trong liệu pháp trên người thì các yếu tố cảm ứng này hoàn toàn không có ý nghĩa.

(2)- Tính cảm ứng: có khả năng cảm ứng cao, tỷ lệ biểu hiện thành công cao.

(3)- Tính dung nạp mạnh: hệ thống điều hòa gene có thể đặt dưới sự điều khiển bởi các thuốc sẵn có hoạt tính sinh học sẵn có, các thuốc này có thể thấm tất cả các mô, nhau thai cũng như hàng rào bảo vệ máu.

(4)- Tính hồi biến: các yếu tố cảm ứng (thuốc) khi đưa vô cơ thể sẽ phụ thuộc vào phác đồ trị liệu, do vậy chúng thường có dược động lực học rất cao, điều khiển cấu hình hệ thống điều hòa gene từ dạng hoang dại sang dạng điều khiển rất nhanh vì thế hệ thống điều hòa gene khi đưa vô cơ thể cũng phải đáp ứng được nhu cầu này.

(5)- Tính phát sinh miễn dịch: hệ thống điều hòa gene nhân tạo khi đưa vô cơ thể phải không kích hoạt hệ thống miễn dịch nội tại hoặc nếu có thì rất thấp.

(6)- Tính linh động: hệ thống điều hòa gene khi đưa vô cơ thể đáp ứng nhanh với các thành phần tham gia điều hòa khác khi có thay đổi để tối ưu hóa phác đồ trị liệu; cũng như nó có khả năng đáp ứng với những hệ thống liệu pháp khác trên cùng một cơ thể bệnh nhân.

(7)- Tính phụ thuộc: hệ thống điều hòa gene phải có mối quan hệ rõ ràng với nồng độ chất cảm ứng đưa vô cơ thể, tức là phụ thuộc liều thuốc đưa vô.

Như vậy để xác lập xây dựng cho được một hệ thống điều hòa gene nhân tạo áp dụng trong liệu pháp gene, người ta bắt buộc phải hiểu thật rõ CÁC HỆ THỐNG ĐIỀU HÒA GENE ĐANG ĐIỀU KHIỂN HOẠT ĐỘNG CÁC GENE TRONG TẾ BÀO ĐỘNG VẬT nhằm mục đích ỨNG DỤNG CÁC HỆ THỐNG ĐIỀU HÒA NÀY TRONG NGHIÊN CỨU Y- SINH HỌC VÀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC.





Concay

Cảm ơn bác con cáy nhiều lắm lắm, em cũng đang tìm những tài liệu về quá trình điều hoà sinh tổng hợp protein, nhưng thầy giáo của em bảo hiện nay khoa học chỉ nghiên cứu được quá trình này trên vi khuẩn, cụ thể là E.coli, nhưng em cứ thắc mắc mãi, bác thử nói dùm em xem: chắc bác đã nghe nói việc sử dụng tế bào gốc (lấy từ tế bào nhau thai hay phôi thai người) để cấy ghép cho các mô cơ quan bị lão hoá, nhưng để làm được vậy người ta phải tìm hiểu quá trình biệt hoá từ tế bào gốc thành tế bào chuyên hoá của mô cơ quan đó chứ? Vậy thực chất của công việc này là thế nào, bác giúp em với.

trả lời cho bạn incon83
bạn cho biết "Quá trình điều hòa sinh tổng hợp .... chỉ được nghiên cứu trên vi khuẩn, cụ thể là E.coli" tôi phân vân không biết nói thế nào:
- hoặc bạn nghe thầy giáo bạn nói lộn (xin lỗi thầy giáo bạn đã lớn tuổi chưa, hay còn trẻ)
- hay là chính thầy giáo bạn lộn???
Thưa bạn, quá trình điều hòa sinh tổng hợp protein được nghiên cứu rộng rãi từ vi khuẩn, động vật, thực vật, tảo, nấm men, nấm mốc, xạ khuẩn. Chẳng hạn với tế bào động vật có đến 9 hệ thống điều hòa sinh tổng hợp protein nội tại và cũng khoảng 9 hệ thống điều hòa gene bên ngoài. Nếu không nghiên cứu trên tb động vật, làm sao người ta có điều này.
Bạn không tin, cứ vào www.google.com gõ
Regulation of protein synthesis animal
sẽ thấy là thông tin dồi dào đến đâu, đó là tôi chỉ mới nói đến ĐV, còn thực vật thì cũng tương tự vậy.
Còn chuyện bạn đề cập đến stem cell thì ý bạn là gì? bạn nói cụ thể xem, tôi không hiểu ý bạn lắm. Bạn đang thắc mắc ý tưởng suy nghĩ của mình hay bạn đang thắc mắc điều mà thầy bạn dạy trên lớn.
Thân
Concay

2. HỆ THỐNG ĐIỀU HÒA GENE NỘI TẠI
Các nỗ lực đầu tiên của các nhà nghiên cứu nhằm phát triển kỹ thuật biểu hiện gene có cảm ứng đều dựa trên các yếu tố nội tại trong tế bào (như là promoter và enhancer) vốn chịu trách nhiệm phản ứng lại các dấu hiệu bên ngoài như nhiệt độ, hormone, giảm oxy, cytokine và kim loại nặng. Nhưng bất lợi chung lớn nhất của các hệ thống này là tác động đa hiệu, nguyên nhân là do các điều kiện cảm ứng nhân tạo đã làm xáo trộn hệ thống điều hòa của tế báo chủ. Một trong những đặc tính quan trọng củ tế bào là tính linh động rất cao, hệ thống điều hòa nội tại luôn được kích hoạt thường xuyên để phản ứng lại các biến đổi của môi trường. Nhưng khi áp dụng các kỹ thuật điều khiển biểu hiện gene có định hướng dựa trên các hệ thống điều hòa gene nội tại thì lại cho thấy là tế bào giảm dần tính linh động và mất dần khả năng phản ứng ngay cả khi cường độ của các kích thích giảm về ỡ ngưỡng cho phép . Điều này cho thấy nếu hệ thống điều khiển biểu hiện gene nội tái không hoạt bình thường, chúng sẽ mất tính tuần hòan và do vậy dễ bị mất hoạt tính. Mặc dù có nhiều khuyết điểm, nhưng kỹ thuật điều hòa gene này vẫn còn sử dụng trong nuôi cấy tế bào động vật; nhưng ở người thì người ta ngăn cản hoàn toàn việc sử dụng cơ chế điều khiển gene nội tại này.
2.1. Kỹ thuật biểu hiện gene dựa trên phản ứng với nhiệt độ
Khả năng đáo ứng lại với sự thay đổi nhiệt độ môi trường bên ngoài là một vấn đề rất cơ bản của sinh vật sống, sự tiến hóa của sinh giới cho thấy sinh vật đã trang bị cho mình nhiều chiến thuật rất tài tình để tồn tại trong phạm vi nhiệt độ có thể chấp nhận được và thậm chí còn tồn tại ở những điểm nhiệt độ cực lạnh hay cực nóng mà các sinh vật khác khó lòng tồn tại. Ở những loài có khả năng chịu được được nhiệt độ tăng cao, người ta đã nghiên cứu chi tiết và khám phá ra các protein sốc nhiệt (heat-shock proteins- HSPs). Các HSPs có tính bảo tồn khá cao giữa các loài sinh vật và khá nhiều HSPs hoạt động như chaperone phân tử trong quá trình gấp khúc của protein.
Hệ thống sốc nhiệt dựa trên Phsp70 . Có thể nói hệ thống điều hòa gene đầu tiên được thiết kế cho tế bào động vật chính là dựa trên cơ chế sốc nhiệt. Công trình của Holmgren và công sự (1979) là công trình đầu tiên liên quan đến các HSPs này, các tác giả đã chỉ định được 4 locus cảm ứng sốc nhiệt trên Drosophila melanogaster. Điều quan trọng nhất của tất cả các locus này là chúng đều chứa promoter của Phsp70 (protein sốc nhiệt có khối lượng phân tử 70 kDal). Promoter này đã được Wurm và cộng sự (1986) sử dụng thành công lần đầu tiên để cảm ứng biểu hiện gene c-myc ở tế bào động vật có vú. Trong công trình này, Wurm đã cho lai giữa Phsp70 với proto-oncogene c-myc và sau đó gắn vào trong nhiễm sắc thể tế bào CHO-DUKX B11-dhfr-- (là dòng tế bào trứng chuột đồng Trung Quốc mang dihydrofolate reductase âm tính) lên đến 2000 copy một tế bào. Các tế bào chứa cấu trúc Phsp70 ?"c-myc với số lượng copy được chọn lựa bằng kỹ thuật methotrexate. Kỹ thuật methotrexate là một kỹ thuật cổ điển nhằm khuyếch đại thông tin di truyền dị thể trong tế bào chủ dựa trên sự mất hoạt lực của dhfr (Urlaub và Chasin, 1980). Các tế bào chứa cấu trúc Phsp70 ?"c-myc sau khi cho ủ ở 43 oC đã tăng cảm ứng tạo ra mRNA c-myc cao gấp 100 lần so với bình thường. Sau đó khi phục hồi lại ở nhiệt độ 37 oC thì các mRNA đã được dịch mã, do vậy 3 giờ đầu tiên ở nhiệt độ 37 oC, protein c-Myc là một trong những protein có hàm lượng cao nhất trong tế bào. Tuy nhiên, điều khá ngặc nhiên là các báo cáo về sau đều cho thấy kỹ thuật biểu hiện gene dựa trên cấu trúc Phsp70 lại cho thấy là mức độ phiên mã cơ bản lại cực kỳ thấp mặc dù các locus sốc nhiệt đã được khuyếch đại. Tuy vậy, chính dựa trên kỹ thuật này, các nhà nghiên cứu đã tạo ra một lượng khá lớn protein c-Myc (Wurm và cộng sự, 1986), CGFs (insulin-like growth factors- yếu tố tăng trưởng giống insulin; Bovenber và cộng sự, 1990), yếu tố đều khiển phiên mã protein của virus HIV (Schweinfest và cộng sự, 1988) để nghiên cứu các đặc tính sinh lý, sinh hóa của các protein này. Ngoài khả năng phiên mã bị giảm sút, các nghiêu cứu cho thấy việc gây cảm ứng nhiệt độ cao còn khiến cho tế bào ngừng tăng trưởng, tăng mức độ tiêu thụ glucose, hiệu suất đặc biệt giảm cũng như giảm khả năng sống của tế bào. Tới nay, duy nhất chỉ có công trình củs Passini và Gouchee (1989) cho thấy có thể sản xuất protein từ dòng hybridoma chuột sốc nhiệt cho hiệu suất cao mà không gây tác động đến khả năng sống sót của tế bào. Trong nhiều nỗ lực nhằm nâng cao quy mô sản xuất các protein liệu pháp khó biểu hiện (không bền, chậm trưởng thành, gây độc cho tế bào, ?), người ta đã cố gắng thiết kế hệ thống biểu hiện gene dựa trên nhiệt độ cũng khá tinh vi khác. Theo đó, người ta tạo ra một dòng tế bào CHO nhạy nhiệt (CHO-ts) mà nó bị ngưng tăng trưởng ở pha G1 sau khi bị xử lý ở nhiệt độ 42 oC trong 72 giờ. Kết quả lặp lại nhiều lần cho thấy là tế bào động vật khi bị ngưng ở pha G1 sẽ cho sản xuất protein dị thể với hiệu suất khá cao. Sau đó để gia tăng hơn nữa hiệu suất, người ta tìm cách kết hợp hai mô hình điều khiển gen nói trên lại với nhau. Tức là người ta đưa một gene sản xuất protein mong muốn đặt dưới sự điều khiển của promoter hsp70 người vào trong dòng tế bào CHO-ts nói trên. Tuy nhiên sự kết hôn này không mang kết quả như ý muốn. Do sự biểu hiện gene dưới điều khiển củaPhsp70 quá khiêm tốn, thậm chí ngay cả khi nó đã được kết hợp với dòng tế bào CHO bị gián đoạn tăng trưởng do nhiệt độ nên lượng protein sản xuất vẫn không đạt mức thông thường khi so với các gene đặt dưới sự điều khiển của promoter virus cơ định. Hơn thế nữa, dòng tế bào CHO-ts lại giảm khả năng sống theo thời gian nuôi cấy ở nhiệt độ cao (nhiệt độ cần cho promoter hsp70 hoạt động). Để khắc phục nhược điểm này, người ta đề xuất là tạo ra một khoảng nhiệt độ thích hợp theo từng thời điểm thích hợp, ví dụ tăng nhiệt độ trong một thời gian ngắn vừa đủ để cảm ứng Phsp70 rồi hạ nhiệt độ xuống để cho phép tế bào sống lâu hơn. Mặc dù vậy, hệ thống này sẽ rất cồng kềnh nếu áp dụng trong công nghiệp. Cho nên trong hệ thống nuôi cấy tế bào liên tục quy mô lớn để sản xuất các protein có dược tính, người ta không khuyến cáo việc dùng nhiệt độ như một tác nhân kích thích.
Concay

Kỹ thuật điều khiển gene dựa trên promoter gene sốc nhiệt hsp16 (Phsp16 ) của C. elegant. Năm 1985 Key và cộng sự đã đưa ra một hệ thống điều hòa gene cũng dựa trên hiện tượng sốc nhiệt, nhưng khác với công trình của Holmgren và sau đó là Wurm, công trình của Key dựa trên sự biểu hiện bền của một cặp hsp16 phiên mã không đồng nhất lấy từ giun tròn Caenorhab***is elegants . Theo đó, Key đã đưa vào nguyên bào sợi chuột, ở nhiệt độ 37 oC, cặp gene hsp16 này không hoạt động phiên mã, nhưng khi sốc nhiệt 42,5 oC trong 2 giờ thì số lượng sản phẩm phiên mã tăng lên đến hơn 10.000 sản phẩm/tế bào. Kết quả này cũng tương tự nếu thay yếu tố nhiệt độ bằng cách gây stress với sodium arsenate. Kay và cộng sự còn cho thấy là trong cùng một điều kiện đặt trong cùng một vector thì promoter của hsp16 (Phsp16) điều khiển gene repoter thymidine kynase virus Herpes simples cho hiệu quả lớn gấp 100 lần so với promoter gốc của gene kinase này (Ptk). Kay và cộng sự còn phân tích chi tiết thấy rằng Phs16 có tính hai hướng và cũng xác định được yếu tố sốc nhiệt tối thiểu (HSE- heat schok element). Theo đó nếu HSE được đặt giữa hai yếu tố TATA (còn gọi là hộp TATA) không đồng nhất thì nó có thể điều khiển phiên mã cho cặp gene hsp16 theo hai hướng khác nhau, nhưng hiệu suất phiên mã sẽ giảm khoảng 10 lần so với dạng thông thường. Và từ nhiều thí nghiệm khác, người ta ghi nhận là cường độ hoạt động của các promoter thúc đẩy các gene sốc nhiệt ở các tế bào động vật khác nhau biến thiên theo số lượng của HSE nằm giữa hai yếu tố TATA. Công trình của Kay và cộng sự trên đối tượng promoter giun tròn Phsp16 đánh dấu 3 sự kiện rất quan trọng trong hệ thống điều hòa gene eukaryote:
01.- đây là promoter cảm ứng với kích thích đầu tiên có thể trả lời với cả nhiệt độ lẫn hóa chất
02.- đây là promoter có tính hai hướng và từ đó mở ra kỹ thuật điều hòa gene nhị phân được sử dụng rộng rãi 10 năm sau đó (xem thêm Baron và cộng sự, 1995; Strathdee và cộng sự, 1999).
03.- đây là báo cáo đầu tiên cho thấy có thể điều khiển cường độ hoạt động của promoter bằng cách thay đổi số lượng các yếu tố DNA tham gia phản ứng với kích thích (HSEs).
Hơn nữa, công trình của Kay còn chứng minh một cách rất rõ nét là có thể sử dụng một promoter của một loài để điều khiển hệ thống gene của một loài vốn cách xa nhau (promoter của giun tròn và tế bào chuột). Do đó các công trình về sau trong nghiên cứu hệ thống điều hòa gene cao cấp hầu như đều sử dụng các yếu tố promoter tối thiểu có nguồn gốc từ các promoter sốc nhiệt dị thể.
Kỹ thuật điều khiển gene dựa trên promoter gene sốc nhiệt hsp68 (Phsp68 ) của chuột. Hai promoter gene sốc nhiệt của ruồi giấm và giun tròn mô tả ở trên là hai promoter đầu tiên ở động vật không xương được nghiên cứu và đưa vào kỹ thuật ứng dụng. Đến năm 1989, Kothary và cộng sự đã đưa một kỹ thuật điều khiển gene khác cũng dựa trên promoter gene sốc nhiệt nhưng là hsp68 (Phsp68 ) của chuột và sử dụng thành công trên chuột chuyển gene. Theo đó, Phsp68 được dung hợp với lacZ (gene mã hóa cho beta-galactosidase ở E. coli) rồi đưa vào nhiều dòng tế bào bào thai và chuột trưởng thành. Sau đó cho sốc nhiệt trực tiếp ở 42 oC với chuột trưởng thành, và sốc nhiệt gián tiếp qua màng nhau thai đối với chuột trong nhau thai ở các giai đoạn phát triển khác nhau. Kết quả quan sát mẫu sinh thiết lấy từ đuôi chuột trường thành cho tỷ lệ biểu hiện của LacZ khá cao, còn trên các tế bào nhau thai ở các giai đoạn phát triển khác nhau cũng cho kết quả tương tự. Ngoài sốc nhiệt, các tác giả còn cho sốc stress với sodium asenate (xem phần trên) và kết quả cũng tương tự. Một điều khá ngạc nhiên đối Phsp68 là nó được điều hòa khá nghiêm ngặt nhưng nó lại chỉ chứa các trình tự cảm ứng đối với nhiệt độ và arsenate rất hiệu quả chứ không chứa trình tự điều khiển cho sự biểu hiện mang tính đặc hiệu cho mô trong suốt giai đoạn phát triển. Cho thấy là sự hoạt động của Phsp68 không mang tính đồng nhất. Một giả thuyết cho rằng kiểu biểu hiện gene theo kiểu mosaic này cũng có thể là kết quả của việc mất khả năng phản ứng nhiệt của một số mô, tế bào nào đó hoặc cũng có thể là do các mô, tế bào khác nhau nhận cường độ kích thích khác nhau sẽ có cường độ phản ứng khác nhau. Đây cũng là hạn chế lớn nhất của kỹ thuật điều hòa biểu hiện gen bằng Phsp68 nên nó không được sử dụng trong kỹ thuật điều khiển gene chuyển ở động vật, nó chỉ có giá trị nhất định trong nghiên cứu nuôi cấy tế bào trong thời gian ngắn.
Concay

Hệ thống điều hoà biểu hiện gene theo cảm ứng nhiệt độ dựa trên replicase nhạy nhiệt của virus alpha Gần đây người ta bắt đầu quan tâm đến một vài thành viên của họ virus Alpha, trong đó có cả Sindid, như là một công cụ di truyền để điều khiển sự biểu hiện protein. Các virus Alpha là những virus mang sợi RNA dương tính, nhân bản một cách chính xác nhờ replicase trong cytoplasma của tế bào chủ bị xâm nhiễm mà không cần có DNA trung gian. Nguyên tắc để sử dụng virus alpha như là một vector DNA điều khiển sự biểu hiện gene cụ thể trong tế bào động vật có vú có thể mô tả qua ví dụ ở hình 02 như sau:

Hình 2A là hệ thống biểu hiện của plasmid pCyTS được cảm ứng nhiệt gồm hai thành phần: phần gene mã hóa cho relicase (nsp1 đến nsp4) được đặt dưới sự điều khiển của PhCMV (PhCMV là promoter có nguồn gốc từ promoter human Cytomegalovirus được cải biến dùng cho tế bào động vật có hiệu suất cao); phần còn lại là gene mong muốn biểu hiện SAEP (secreted alkaline phosphatase) được điều khiển bởi promoter PSG của virus alpha (alphaviral subgenomic promoter). Do replicase virus có tính độc với tế bào nên virus alpha bị hạn chế sử dụng trong nghiên cứu điều khiển gene, để khắc phục nhược điểm này người ta tạo một biến thể bằng cách gây đột biến trên gene nsp2 (nsp2*) khiến replicae mất độc tính đối vối tế bào. Ngoài ra người ta cũng tạo ra một đột biến trên gen nsp4 (nsp4*) khiến replicase sẽ nhạy với nhiệt độ cao. Toàn bộ hệ thống pCyTS sẽ được chuyển vô tế bào động vật và tích hợp bền vào bộ gene của tế bào chủ. Dưới sự điều khiển của promote PhCMV này, sợi mRNA dương tính (+mRNA) chứa thông tin của replicase cũng như PSG và SAEG sẽ được tạo thành và chuyển ra ngoài tế bào chất (hình 2B). Tại đó, Rep được dịch mã phụ thuộc nhiệt độ; nếu nhiệt độ > 35oC tạo ra dạng Rep không hoạt động; nếu nhiệt độ < 35 oC thì tạo ra dạng Rep hoạt động (hình 3C). Enzyme này đến phiên nó sẽ kích hoạt cho quá trình sao chép sợi ?"mRNA (hình 2D) đồng thời điều khiển sự biểu gene SAEP thông qua promoter PSG (hình 2E) tạo ra sợi +mRNA. Sau đósợi +mRNA chứa thông tin của gene SAEP sẽ được dịch mã thành protein nghiên cứu SAEP. Hệ thống điều khiển biểu hiện gene dựa trên cảm ứng lạnh của pCytTS này đã được phát triển và ứng dụng trên nhiều dòng tế bào động vật khác nhau như BHK-21; myoblast COS-7 và C2C21 cho kết quả rất khả quan mang thoả mãn cả hai tính chất: điều hòa rất nghiêm ngặc và mức độ biểu hiện cao. Tuy nhiên, bất chấp khả năng điều hòa có nhiều thuận lợi không chối cãi, hệ thống này có những nhược điểm sau:
1.- do nó chỉ được cảm ứng ở nhiệt độ dưới ngưỡng sinh lý (29 oC) nên hoàn toàn không phù hợp với liệu pháp gene in vivo;
2.- protein tạo ra thường với số lượng thấp, chất lượng không cao và mang tính kháng nguyên cao nguyên nhân là do tỷ lệ đột biến cao của replicase;
3.- đột biến mất độc tính của nsp2* dễ hồi tính trong nhiều dòng tế bào động vật;
4.- khi nuôi ở nhiệt độ thấp nên tốc độ tăng trưởng của các dòng tế bào động vật thí nghiệm thường rất thấp.
Cũng cần nói thêm là kỹ thuật nuôi cấy tế bào ở nhiệt độ thấp dưới ngưỡng sinh lý nhằm tạo ra protein dị thể có chất lượng cao đã thu hút nhiều quan tâm của các nhà nghiên cứu. Hầu hết các dòng tế bào động vật đều phản ứng lại nhiệt độ thấp kéo dài bằng cách ngưng tăng sinh ở pha G1, điều này có liên quan mật thiết đến hiệu suất nuôi cấy tế bào.
Ngược lại với các cơ chế phản ứng sốc nhiệt độ cao, cơ chế điều khiển phản ứng đáp ứng với nhiệt độ thấp của tế bào vẫn chưa được biết rõ. Một điều rõ ràng mà người ta nhận thấy là nhiệt độ thấp đã cảm ứng cho protein sốc nhiệt lạnh (CSP cold- shock protein), nhưng không như các protein sốc nhiệt cao, các CSP lại không có cùng chung cấu trúc hay chức năng; do vậy mà người ta hầu như chưa xác định được nhiều promoter của các CSP này. Do vậy hướng sắp tới người ta sẽ cố gắng tập trung xác định tính chất của các promoter sốc nhiệt lạnh nhằm thúc đẩ sự tăng năng suất với các dòng tế bào nuôi cấy ở nhiệt độ thấp.
Ngoài hệ thống pCytTS vừa kể, gần đây người ta cũng đã phát triển một hệ thống bieu hiện gene cảm ứng nhiệt độ thấp dựa trên LTR của HIV-1 (LTR là trình tự lặp lại ở vùng tận cùng kéo dài- long terminal repeat). Kết quả cho thấy khi cho lai giữa HIV1 LTR với một số gene reporter và cho xâm nhiễm vô tế bào Hella hay nguyên bào sợi chuột và cho cảm ứng ở nhiệt độ 25 oC cho thấy mức độ biểu hiện của các gene reporter này tăng lên vài lần. Ngoài phản ứng với nhiệt độ thấp, hệ thống biểu hiện gene dựa trên HIV1 LTR còn cho thấy nó có thể phản ứng với phorbol ester, lectins, cytokines, interleukin 6, các yếu tố kìm hãm kianase protein, yếu tố oxy hóa, tia UV và thậm chí cả sốc nhiệt cao. Do có quá nhiều yếu tố có thể tác động lên hệ thống HIV1 LTR như vậy, nên người ta chưa thể tối ưu hóa hệ thống này để có thể điều khiển chính xác sự biểu hiện của protein trong tế bào động vật có vú. Hiện nay người ta đang hy vọng là có thể tìm hiểu được bản chất của Cirp (cold-inducible RNA- binding protein- protein gắn loên RNA có khả năng cảm ứng lạnh). Cirp chính là phân từ đóng vai trò quan trọng trong mối liên hệ giữa sốc lạnh và sự gián đoạn chu trình tế bào. Ở nguyên bào sợi, Cirp biểu hiện khá cao trong khoảng nhiệt độ trên dưới 32 oC. Tương tự với Corp, mức độ phiên mã của RMB3 (một thành viên của họ protein gắn lên RNA giàu glycine) khá cao ở tế bào người khi cảm ứng nhiệt trong khoảng trên dưới 32 oC. Tuy vậy, promoter của hai protein này vẫn đang được xác định nhằm làm sáng tỏ cơ chế phản ứng nhiệt độ thấp.
Protein nhaỵ nhiệt. Bên cạnh khái niệm điều hòa biểu hiện gene bằng cảm ứng nhiệt dưới sự điều khiển của promoter sốc nhiệt, người ta còn lưu tâm đến các protein đột biến mà sự biến tính và gấp khúc của nó không bình thường khi nó bị đặt trong khoảng nhiệt độ bất bình thường. Các protein đột biến này đã được nghiên cứu trên nhiều sinh vật khác nhau. Thông thường các công tắc protein phản ứng rất nhanh với các biến đổi môi trường (trong khoảng mili-giây đến giây) và không chịu sự điều khiển của bất kỳ cơ chế điều hòa phiên mã, dịch mã thông thường nào (các cơ chế điều hòa này mất vài phút). Tuy nhiên khi nghiên cứu trên tế bào động vật, người ta hầu như rất khó chỉ định được các allele nhạy nhiệt độ cao (ts) và allenle nhạy nhiệt độ thấp (cs), thậm chí dùng đến phương pháp gây đột biến ngẫu nhiên và đột biến từng điểm một tiếp nối (còn gọi là đột biến quét theo đường thẳng). Dựa trên các protein nhạy nhiệt này Dohmen và cộng sự (1994) đã hình thành kỹ thuật sản xuất các protein nhạy nhiệt mà không cần dò tìm các dạng đột biến của nó. Theo đó, các tác giả sử dụng peptide được đánh dấu là sẽ phân rã nhạy nhiệt cao gọi là degron (degradation regulon) để lai với đầu N-tận cùng không bền của một protein dị thể. Trong báo cáo của Dohmen, sản phẩm lai là Arg-DHFR, tức là một dihydrofolate reductase nhạy nhiệt của chuột được lai với một protein kỹ thuật có mang arginine ở đầu tận N, arginine là một amino acide không bền, khi nó đứng ở cuối đầu N nghĩa là đó là dấu hiệu của sự phân rã theo quy tắc ?ođầu cuối N?o. Sau đó, Arg-DHFR được cho lai lần lượt với Ura3 và Cd28. Kết quả cho thấy là sản phẩm protein của hai gene chuyển đều biểu hiện tốt ở nhiệt độ 23 oC (nhiệt độ hoạt động của DHFR) nhưng khi nâng lên 37 oC (nhiệt độ cao mà DHFR không hoạt động và dễ dàng phân rã khi có mặt arginie) thì không thấy sản phẩm dịch mã. Điều này cho thấy là có thể tạo sản phẩm protein Ura3 và Cd28 ở nhiệt độ thấp mà không cần dò tìm đột biến tương ứng của nó. Nhưng các ứng dụng của kỹ thuật kích hoạt protein dựa trên ts và cs bị giới hạn vì khi đưa nhiệt độ lên cao hay xuống thấp để kích hoạt protein mong muốn, thì có thể lại gây đột biến cho một vài protein đặc biệt nào đó.
2.2. Kỹ thuật điều hòa gen nhờ kim loại nặng
Concay

Vấn đề này quả thật rất hay và thú vị. Rất mong anh concay tiếp tục post bài về nó. Nếu có gì không hiểu em có thể trao đổi thêm với anh không ạ.
Xin hỏi một câu riêng tư, anh có thể không trả lời: "Anh có thể cho em biết nguồn tài liệu để viết mấy bài trên anh lấy ở đâu không ạ".
Cảm ơn anh nhiều
Casper

cám ơn "con ma vui ve casper" đã quan tâm đề tài này:
01- Lưu ý là do post lên dây nên một số định dạng bị sai, ví dụ tên gene phải viết nghiêng, ... nên ở đây chỉ đọc để tham khảo, chứ bài viết đúng chỉ có thể đọc trên trang WORD thôi. Tôi dự tín sau khi viết xong sẽ chuyển thành dạng PDF và chuyển sang dạng GIF để dán lên đây lần nữa (nếu có time).
02- Tài iệu tôi dùng để viết bài này khá nhiều kể cả sách lẫn bài báo, có cái dạng PDF có cái photo...
03- Hoan nghênh mọi ý kiến trao đổi và đóng góp của bạn, tôi đang sẵn sàng chờ.
Thân
Concay

2.2. Kỹ thuật điều hòa gen nhờ kim loại nặng
Các metallothionin (MT) là các protein có khối lượng phân tử thấp, nhưng có độ bảo tồn cao và gắn ion kim loại thông qua khung kim loại-thiloate ở những gốc cysteine. Mặc dù vai trò chính xác của các MT chưa được xác định rõ rệt nhưng cơ bản người ta nhận thấy là MT đóng vai trò rất quan trọng trong nhiều con đường tế bào bao gồm cả sự cân bằng nội mô, bảo vệ tế bào, khử độc tố trong nhiều đáp ứng rất quan trọng. Do có nhiều chức năng như vậy, nên người ta cũng ghi nhận là cũng có khá nhiều yếu tố có thể cảm ứng cho sự phiên mã các MT, ví dụ như mitogens, cytokines, các hormone như glucocorticoids, progesrterones. Trong nhiều trường hợp các yếu tố hoạt động dạng cis của gene MT cho thấy là chúng cũng tham gia điều hòa để phản ứng lại với các yếu tố cảm ứng. Một điểm đáng lưu ý là với nhiều gene MT khác nhau thì các yếu tố phản ứng đặc hiệu với các cảm ứng bên ngoài cũng khác nhau, các yếu tố phản ứng đặc hiệu này có thể tồn tại ở dạng đơn lẽ mà cũng có thể ở dạng kết hợp. Ví dụ trong số những thành viên của họ MT trên người, chỉ có promoter gene hMT-IIA (PhMT-IIA) là mang yếu tố phản ứng lại với glucocorticoids. Đối với các gene MT thì ion kim loại được xem là yếu tố cảm chung cho tất cả các gene MT này, hơn nữa tất cả các promoter MT từ Drosophila cho đến người đều chứa nhiều bản copy của các trình tự bán bảo tồn gọi là yếu tố phản ứng kim loại (MREs metal-responsive elements). MREs như tên gọi của nó, tức là nó chịu trách nhiệm về khả năng thúc đẩy phản ứng của các promoter MT khi các promoter này bị kim loại tác động, đặc biệt là Cd2+ và Zn2+. Các MRE thường dài khoảng 12-15 bp, chứa một lõi heptanucleotide bảo tồn rất cao có công thức là TGC(A/C)CNC, ngoài ta còn một vùng phụ cận có tính bảo tồn kém. Khả năng thúc đẩy của các promoter gene MT được điều hòa thông qua yếu tố được kích hoạt bằng kim loại (MAFs metal-activated factors) khi các MAFs nhận diện các MREs nằm bên trong promoter MT. Có thể điểm qua một ví dụ ứng dụng thành công khi kết hợp promoter MT với những yếu tố cảm ứng khác cho đến nay. Ví dụ, công trình của Filmus và cộng sự (1992) đã tạo ra một promoter metallothionein ở người (PhMT-IIA) mang cả các yếu tố phản ứng glucocorticoid (GREs- Glucocorticoid responsive elements) lẫn MREs bằng cách loại bỏ bớt một vài yếu tố cơ định và dưa GRE vào khiến cho promoter dạng khảm này có khả năng phản ứng đồng thời với cả hai yếu tố kích thích là CdCl2 và dexamethasone. Kết quả cho thấy hiệu xuất cảm ứng trên gene reporter CAT (chloramphenicol acetyltransferase) của promoter được hiệu chỉnh này cao hơn rất nhiều lần so với PhMT-IIA dạng hoang dạihoặc promoter MMTV-LV được cảm ứng bằng glucocorticoid riêng rẽ. Đặc biệt khi CdCl2 và hexamethasone được cho vào môi trường đồng thời thì hiệu quả tác chiến lên đến 65 lần. Kết quả của Filmus và cộng sự còn cho thấy là hiệu xuất cản ứng còn phụ thuộc số lượng và vị trí các GREs đưa vào. Mặc dù cho hiệu suất cao như vậy, nhưng hệ thống điều hòa biểu hiện gene dựa trên kim loại nặng lại hầu như ít được sử dụng trên tế bào động vật vì :
1.- tính độc của kim loại nặng đối với tế bào;
2.- các promoter phải chứa khá nhiều các yếu tố phản ứng với các nhân tố phiên mã dày đặc (phần lớn là các nhân tố phiên mã cơ định) nên các promoter này thường biểu hiện ở mức cơ bản cao, vì vậy tỷ lệ kích hoạt khá thấp (thường thì không lớn hơn 5-10 lần);
3.- tính chất không chuyên biệt, tức là promoter MT có thể phản ứng với nhiều yếu tố kích thích bên ngoài đồng thời nên khó tối ưu hóa hệ thống.
2.3. Kỹ thuật điều hòa gen nhờ dioxin
về cơ bản có thể thấy kho dược liệu của nhân loại bao gồm thuốc và các hợp chất hóa học có khả năng ức chế có chọn lọc và vì vậy điều hòa chức năng của protein bệnh nào đó. Nhưng cần lưu ý là các hóa chất này chỉ dùng để điều hòa chỉ với một số rất nhỏ các protein và luôn luôn có những tác dụng phụ không mong đợi. Bên cạnh việc chấp nhận thuốc và hóa chất để điều hòa những protein sai hỏng, tế bào phải nỗ lực hết mình để phân rã càng nhanh càng tốt các thuốc và hoá chất nói trên. Vì thế để đáp ứng nhu cầu này, tế bào cần phải có những enzyme chống lại các hóa chất bên ngoài bằng cách oxy hoá các chất ngoại lai và tống các chất này ra ngoài. Vai trò này được cytochrome P-450 đảm nhận, cytochrome p-450 là một nhóm gồm nhiều enzyme nằm trong mạng lưới nội chất, đóng vai trò rất quan trọng trong việc điều hòa trao đổi thuốc, hoạt động của chúng được điều hòa khá nghiêm ngặt nhờ các yếu tố cảm ứng có bản chất hóa học nói trên. Có khoảng 27-30 isoenzyme đã được nhận diện ở người và phân chia thành các lớp phụ. Một trong những gene thu hút sự quan tâm là CYP1A1A cytochrome P-450s (nghĩa là gene thuộc họ phụ 1, polypeptide 1 của cytochrome P-450s) nằm trong tế bào động vật có vú. Bình thường thì CYP1A1A cytochrome P-450s không phiên mã, nhưng khi có sự xuất hiện của các hợp chất như polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH), tetrachlorodibenzo-ρ-dioxin (TCDD), β-napthoflavone (BNF) và polychlorinated biphenyls (PCBs). Quá trình cảm ứng của gene CYP1A1A cytochrome P-450s được điều hòa qua yếu tố phiên mã đồng phân dị thể chứa đồng thời receptor aryl hydrocarbon và yếu tố hóan vị nhân aryl hydratcarbon khi yếu tố phiên mã này sẽ gắn lên yếu tố DNA đặc hiệu bên trong promoter của gene này. Khả năng điều hòa gene nhờ sử dụng promoter gene CYP1A1A cytochrome P-450s của chuột và người đã được chứng minh cho thấy nó có tiềm năng rất lớn trong kỹ thuật gene liệu pháp. Theo đó, người ta tạo ra một dòng chuột chuyển gene thí nghiệm có gene apoE bị suy yếu nên chúng mắc bệnh dư cholesterol trong máu, sau đó dưa gene apoE lành dưới sự điều khiển của promoter gene CYP1A1A cytochrome P-450s . Gene này bình thường vẫn không biểu hiện, nên hàm lượng cholesterol trong máu vẫn cao, chỉ khi tiêm BNF vào chuột để kích hoạt promoter gene CYP1A1A cytochrome P-450s hoạt động thì gene apoE được biểu hiện và kết quả là hàm lượng cholesterol giảm rất mạnh mẽ. BNK còn cho thấy nó có thể truyền qua nhau thai để tác động lên bào thai đang phát triển. Và nó còn có thể truyền qua sữa khi chuột mẹ cho con bú. Một thí nghiệm khác do Campbell và cộng sự tiến hành năm 1996 trên một mảnh promoter gene CYP1A1A cytochrome P-450s dài 8,5 kb cũng trên chuột chuyển gene cho thấy khi cảm ứng bằng 3-methylcholanthreen và dioxin thì mức độ biểu hiện của gene thí nghiệm (β-galactosodase) lên đến trên 1000 lần ở nhiều mô như gan, thận, tuyến thượng thận, phổi và cơ quan sinh sản. Điều này cho thấy hệ thống này có thể điều khiển theo phương thức tắt/mở trên nhiều mô thí nghiệm khác nhau rất hiệu quả. Tuy nhiên hệ thống điều hòa biểu hiện gene bằng dioxin và các hợp chất hóa học chỉ có giá trị nhất định chứ không thể áp dụng rộng rãi do 2 lý do:
1.- mảnh promoter gene CYP1A1A cytochrome P-450s dài 8,5 kb nói trên rất khó tạo dòng do nó quá dài nhưng cơ bản là do
2.- dioxin và các chất cảm ứng khác vốn là chất độc, không phù hop với liệu pháp trên người.
2.4. Kỹ thuật điều khiển sự biểu hiện gene nhờ sự tăng áp oxy
Concay

2.4. Kỹ thuật điều khiển sự biểu hiện gene dựa trên sự tăng áp oxy
Năm 1996, Wang và Semenza và sau đó là năm 1998 Ratchliffe lần lượt khám phá ra vài gene liên quan đến sự tăng áp oxy (nồng độ oxy môi trường tăng cao). Khám phá này đặt nền tảng cho Rinsch và cộng sự (1997) thiết kế một hướng điều khiển sự biểu hiện gene mới dựa trên sự tăng áp oxy. Để điều trị bệnh thiếu máu, người ta dùng liệu pháp là tiêm protein hEpo (human Erythropoeitein) tái tổ hợp với liều nhẹ dưới da cho bệnh nhân, điều này giúp cung cấp một lượng hEpo trong ngưỡng sinh lý cho phép điều hòa sự thiếu máu này. Rinsch và cộng sự đã tạo ra một vector trong đó đoạn cDNA hEpo được đặt dưới sự điều khiển promoter gene phosphoglycerate kinase của chuột. Sau đó vector này được chuyển vào dòng mycoplast C2C12 chuột. Promoter gene phosphoglycerate kinase như đã nói nó phản ứng với sự ăng áp oxy, do đó trong điều kiện in vitro, khi oxy tăng trong khoảng 1,3 đến 21% thì mức độ biểu hiện của gene hEpo tăng lên gấp 3 lần. Sau đó các tế bào C2C12 có khả năng biểu hiện gene hEp được thu nhận và tiêm vào chuột đang mang bệnh thiếu máu, kết quả cho thấy khi có mặt của các tế bào này thì chuột chỉ cần 7% oxy trong môi trường là có thể tăng hàm lượng protein hEpo trong huyết thanh lên 2 lần so với trường hợp đối chứng phải cần đến 21% oxy.
Nghiên cứu trình tự hoạt động dạng cis cảm ứng bởi sự tăng áp oxy trên gene Epo đã khám phá ra yếu tố cảm ứng tăng áp oxy(HIF-1 hypoxia inducble factor-1). HIF-1 thực chất là một phức hợp gắn lên DNA cho phép gene được phiên mã khi nồng độ oxy môi trường tăng cao (tăng áp oxy). Sau đó, người ta còn khám phá ra thêm nhiều gene khác cũng chịu ảnh hưởng củs HIF-1 như gene điều hòa trao đổi năng lượng tế bào, trao đổi sắt, trao đổi catecholamine, điều hoà vận mạch, quá trình tạo mạch máu cho thấy là oxy đóng vai trò rất quan trọng trong nhiều cơ chế hoạt động của tế bào. HIF-1 chứa một đồng phân dị thể gồm hai protein xoắn-vòng-xoắn cơ bản của họ PAS, nên tương ứng gọi là HIF-1α và HIF-1β. Các nghiên cứu chi tiết hơn sau đó cho thấy chỉ có dạng HIF-1α chịu trách nhiệm chính với sự oxy tăng áp. Rarchcliffe và cộng sự (1998) đã tạo ra một nhân tố phiên mã dạng khảm Gal4-HIF-1α-VP16 gồm 3 thành phần (1) Gal4 là vùng gắn DNA lấy từ yếu tố phiên mã Gal4 ở nấm men, (2) HIF-1α đã giới thiệu ở trên và (3) VP16 là vùng hoạt động mạnh của V16 virus H. simples. Nhân tố phiên mã này sẽ tham gia kích hoạt sự hoạt động của promoter tối thiểu chứa điểm gắn Gal (Gal4-Pmin). Cả hai yếu tố phiên mã dạng khảm Gal4-HIF-1α-VP16 và Gal4-Pmin cùng được đưa vào một tế bào để điều khiển gene reporter luciferase. Trong điều kiện bình thường thì gene luciferse không biểu hiện hoạt động, nhưng khi tế bào được cho tiếp xúc với ion coban, oxy tăng áp hoặc desferrioxamine thì luciferase lại biểu hiện rất mạnh. Kết quả nghiên cứu cơ bản này cho thấy khả năng nhạy oxy của HIF-1α có thể giải thích là bình thường khi ở điều kiện nghèo oxy, nó bị phân giải và không hoạt động nhưng khi có sự tăng áp oxy thì nó được tự do và vì vậy hoạt động trở lại. Và vì thế khi có sự tăng áp oxy, yếu tố phiên mã dạng khảm Gal4-HIF-1α-VP16 đã hoạt động và kích hoạt cho Gal4-Pmin thúc đẩy sự biểu hiện của luciferase.
Mặc dù kỹ thuật điều khiển sự biểu hiện gene dựa trên sự tăng áp oxy thành công ở cà hai mức độ in vitro và in vivo, nhưng nó thật sự không thể áp dụng trong liệu pháp trên người vì lý do cơ bản là người ta không thể điều khiển thông số nồng độ oxy trong kỹ thuật liệu pháp tương ứng này vì mỗi mô khác nhau trong cơ thể người sẽ có một giá trị tăng áp oxy tương ứng khác nhau, nên không thể tối ưu hóa thông số này được.
Concay