DNA sequencing

Năm 1975 đánh dấu sự kiện một bộ gene hoàn chỉnh được giải trình đầu tiên, đó là một bacteriphage ~X174 khoảng 5kb. Tiếp theo sau đó, hàng loạt bộ gene được giải mã, như virus SV40 (5kb, 1977), DNA ti lạp thể của người (16 kb, 1981), bacteriophage lamda λ (49 kb, 1982) và virus Epstein Barr chứa đến 170kb (1984). Tuy nhiên, mãi đến 1995, thì công việc giãi mã genome mới thực sự đạt được một cột mốc quan trọng khi bộ gene của một sinh vật sống độc lập Haemphilus influenzae được giải mã hoàn chỉnh với độ dài lớn gấp 10 lần bộ gene của virus Epstein Barr (tức khoảng 1800 kb). Sáu năm sau, tức tháng 2 năm 2001, hai nhóm độc lập, một được tài trợ từ kinh phí chính phủ (Human Genome Project) và một công ty tư nhân Celera, đã đồng thời công bố bộ gene người hoàn chỉnh, theo tính toá sơ bộ thì không dưới 3 tỷ cặp base. Lần lượt, trước và sau cột mốc đó, các bộ gene của các sinh vật đóng vai trò quan trọng trong nghiên cứu sinh học hiện đại đã được giãi trình như E. coli, giun tròn Caenorhab***is elegans (thường gọi vắn tắt là C. elegans), ruồi giấm Drosophila và Arabidopsis (được mệnh danh là ruồi giấm của thực vật)., chuột Musmusculus, muỗi... Các dự án giải trình genome này đã kích thích và thu hút nhiều sư quan tâm của công chúng, vì các dự án này thể hiện cái gọi là ?ocạnh tranh trong sự hợp tác toàn diện?o, một kết quả tất yếu của sự toàn cầu hóa trong nghiên cứu khoa học. Hơn thế nữa, khi thực hiện các nhà khoa học đã cho thấy một cuộc cách mạng, một cuộc tiến hoámạnh mẽ về kiến thức, phương pháp luận của lĩnh vực genome, đặc biệt là các kỹ thuật giải mã với tần xuất cao.

Giải trình tự là bước cơ bản đầu tiên để xác định tính chất sinh hóa học của một đại phân tử sinh học. Do vậy khái niệm giải trình tự cũng đúng khi ta đọc trình tự acid amine của protein và acid nhân. Việc xác định trình tự protein là một công cụ rất quan trọng trước khi gene tương ứng của nó được xác định (nhân dòng và giải mã). Quan hệ giữa trình tự gene và trình tự protein là hai chiều, nghĩa là từ trình của cái này người ta suy luận ra cái kia và ngược lại. Do vậy cả hai hướng giải trình DNA và protein vẫn như là một đôi ngựa sóng đôi trên con đường chinh phục khoa học. Bài viết này sẽ tập trung vào công việc giải mã gene chứ không đề cập đến protein.

Cơ sở khoa học của việc đọc trình tự DNA

Bất chấp đoạn DNA cần xác định là một plasmid tái tổ hợp, một gene tự nhiên hay toàn bộ genenome của sinh vật thì việc đọc trình tự cũng chỉ là xác định thành phần các base và thứ tự các base này tạo nên đoạn DNA. Đó cũng là cách hiểu hiểu đơn giản và đầy đủ nhất.

Với sự ra đời của các máy đọc trình tự tự động, việc giải mã đã có những bước đột phá với tốc độ nhanh hơn, chính xác hơn: hơn thế nữa cùng với sự trợ giúp của máy tính việc giải mã một đoạn gene đơn lẻ hay toàn bộ genome không còn là một trở ngại về mặt kỹ thuật hay thời gian. Nhưng cho dù có nhiều biến thể của việc đọc trình tự ở nhiều protocol khác nhau, hay máy đọc trình tự tự động khác nhau, nhưng về cơ bản thì cơ sở (phương pháp luận) của việc đọc và giải trình tự là như nhau.

Vào giữa thập kỹ 1970, hai quy trình giải trình DNA khác nhau đã được đưa ra gần như cùng một lúc:

1. Phương pháp của Sanger (1977) cho rằng trình tự của một sợi DNA đơn có thể được xác định bằng cách tổng hợp (nhờ xúc tác của enzyme) sợi bổ sung tương ứng, nhưng sản phẩm tổng hợp sẽ bị chấm dứt tại một điểm đặc biệt nào đó.

2. Phương pháp của Maxam và Gilbert (1977) lại dựa trên các phản ứng hóa học, cắt đứt sợi đôi DNA tại vị trí đặc biệt. (xem thêm Sinh học phân tử, Hồ Huỳnh Thùy Dương, NXB Giáo Dục, 1997)

Nhưng phương pháp hóa học đã không còn được sử dụng rộng rãi ngày nay do những độc tính mà các hoá chất có thể gây ra với người sử dụng. Vì vậy hiện chỉ còn mỗi phương pháp của Sanger là được tín nhiệm. Phương pháp của Sanger còn được biết với tên gọi khác là giải trình dideoxy. Để hiểu được quy trình dideoxy, có lẽ chúng ta cần nhắc lại hai bước cơ bản trong quá trình tổng hợp DNA:

- đầu tiên, sự tổng hợp của sợi DNA không thể bắt đầu từ một cách ?otùm lum?o mà phải có những điều kiện nhất định có chọn lựa. Trước tiên, mồi sẽ gắn lên khuôn. Sự tổng hợp sợi DNA mới sẽ diễn tiến bằng cách gắn thêm các base vào mồi và các base được gắn thêm phải tuân thủ quy tắc ?obắt cặp bổ sung?o với sợi khuôn. Do vậy, khi chúng ta có một mồi gắn lên ở một ví trí đặc biệt đã được chỉ định trước, thì chúng ta có thể đảm bảo rằng tất cả các sợi DNA mới tổng hợp sẽ được tạo thành từ cùng một điểm khởi sự trên sợi khuôn.

- Thứ hai, việc gắn thêm base lên sợi DNA mới tổng hợp sẽ được thực hiện thông qua việc tạo thành khung phosphoester đồng hóa trị giữa gốc 5?Tphosphate của sợi DNA mới (sợi DNA bị gắn thêm base) và nhóm 3?T-OH của base tự do (tức base sẽ bị kéo vào sợi mới). Cơ chất tham gia phản ứng này chính là một 5?TdNTP, ví dụ một deoxynucleotid có 3 nhóm phosphate ở vị trí 5?T của đường deoxyribose;2 trong số 3 phosphate này sẽ bị loại đi khi phản ứng xảy ra.

Thành phần đường của các hợp chất tự nhiên thường là 2?T-deoxyribose khá chuyên biệt. Nghĩa là nó không có nhóm hydroxyl tại vị trí 2?T (điều này cần phân biệt với đường ribose tham gia trong phân tử RNA). Nhưng nó lại có một nhóm 3?T-OH, đó chính là điều kiện cần thiết để tạo khung sườn phosphodiester khi một base mới muốn gắn vào thêm. Như vậy, câu hỏi đặt ra là, điều gì sẽ xảy ra nếu chúng ta sử dụng một đường thiếu nhóm 3?T-OH ví dụ dẫn xuât của 2?T, 3?T- dideoxy, một ddNTP? Điều xảy ra là gốc đường ?okhuyết tật?o này vẫn gắn được vào gốc đường trước đó thông qua khung sườn phosphodiseter như đã nói, nhưng do không có gốc 3?T-OH nên nó lại không thể tạo phản ứng liên kết mới với bất kỳ một gốc đường nào khác. Nghĩa là không một base nào có thể được gắn vô với anh chàng có gốc đường ?okhuyết tật?o này. Nói dễ hiểu, một người dùng tay phải của mình để nắm tay trái người kia để hình thành một chuỗi người. Một anh chàng cụt tay trái vẫn có khả năng dùng tay phải của mình để nắm người đằng trước, nhưng sẽ không ai nắm được anh ta vì anh ay bị thiếu tay trái. Đến đây, sự sinh tổng hợp DNA coi như chấp dứt.

Bằng cách lợi dụng đặc tính trên mà Sanger đã đưa ra phương pháp đọc trình tự của mình. Thông thường, hỗn hợp dNTP là dATP, dTTP, dGTP va dCTP được sử dụng để tham gia phản ứng tổng hợp DNA. Do vậy, nếu chúng ta thêm vô hỗn hợp này một dẵn xuất dideoxy, ví dụ thay thế dATP bình thường bằng dẫn xuất 2?T,3?T dideoxy có đánh dấu gọi là ddATP, khi đó quá trình tổng hợp DNA sẽ ngừng lại khi ddATP bị gắn vào sợi DNA đang được kéo dài. Lưu ý, hỗn hợp dNTP vẫn có đủ 4 thành phần dATP, dTTP, dGTP va dCTP và có thêm sự hiện diện của ddATP. Phản ứng được thực hiện lại, nhưng thêm ddGTP; và cứ như vậy, chúng ta có 4 phản ứng riêng biệt với sự tham gia ?ophá đám?o của 4 ddNTP khác nhau.

Quay trở lại trường hợp có sự hiện diện của ddATP, chúng ta thấy đầu tiên, ta giả sử có một T trên sợi khuôn, nghĩa là trên sợi đang tổng hợp phải là vị trí của A. Nếu vị trí này bị ddATP gắn lên thì quá trình tổng hợp sợi DNA chấm dứt. Nhưng nếu dATP được gắn vô, thì quá trình tổng hợp sẽ tiếp tục. Chuỗi DNA sẽ tiếp tục đến vị trí T kế tiếp, và kịch bản lại lặp lại như trên. Do vậy, trong hỗn hợp tổng hợp sau cùng, chúng ta sẽ thu nhận được nhiều phân tử DNA có độ dài khác biệt và tất cả chúng đều chấm dứt tại vị trí A. các sản phẩm có độ dài khác nhau này có thể phân biệt và quan sát đễ dàng trên gel polyacrylamide biến tính (điều kiện biến tính được sử dụng nhằm tránh hiện tượng các sợi DNA sẽ tạo các cấu trúc bậc hai bất thường khiến cho việc di chuyển của chúng trên trường diện di bị sai lệch, các điều kiện kỹ thuật chi tiết cho việc chạy điện di gel polyacremide không bàn ở đây). Kết quả quan sát trên trường điện di là một loạt các vạch có chiều dài khác nhau (sợi ngắn nhất chạy nhanh nhất), và tất cả đều có vị trí tận cùng là T trên sợi khuôn. Lặp lại thí nghiệm với ddGTP (ddTTP, ddCGP) chúng ta sẽ thu được 4 đường diện di, và từ đó có thể suy luận ra trình tự của sợi DNA.

Với kỹ thuật đọc DNA bằng tay, các phản ứng còn có thể thực hiện với một trong 4 dNTP được đánh dấu bằng đồng vị phóng xa, do vậy khi đọc gel với phim tia X quang, kết quả hiện lên là một vạch màu đen trên nền trắng. Do các mảnh nhỏ nhất sẽ di chuyển nhanh nhất, khi đó chúng ta sẽ đọc kết quả từ dưới lên trên.


Đọc trình tự bằng các máy tự động

Ngày nay, hầu như tất cả các DNA được đọc là nhờ vào mày. Mặc dù cơ sở khoa học là như nhau, nhưng mỗi biến thể của mỗi dạng máy khác nhau sẽ có nhiều điểm khác nhau, mà chủ yếu là khác biệt về phương cách dò tìm các chỉ thị đã được đánh dấu trước đó. Chỉ thị đánh dấu có thể là primer hoặc ddNTP, chúng sẽ được gắn thêm với thuốc nhuộm phát huỳnh quang. Chất nhuộm sẽ gắn vào ddNTP, ví dụ màu đỏ gắn cho ddATP, màu xanh gắn cho ddCTP, màu vàng gắn cho ddGTP và màu xanh dương gắn cho ddCTP. Phản ứng tổng hợp xảy ra với sự hiện diện của cả 4 ddNTP này bên cạnh sự có mặc hiển nhiện của 4 dNTP tương ứng. Sau khi phản ứng chấm dứt, tất cả sản phẩm sẽ được đưa lên cùng một làn đọc của máy và hiển nhiên các sản phẩm có độ dài nhỏ nhất lại sẽ được nhận diện sớm nhất. Do vậy, thay vì chạy trên gel polyacremide vừa tốn thời gian lại có nhiều sai sót khi đọc kết quả, máy đọc trình tự sẽ sử dùng chùm sáng laser để đọc (nhận diện) chất phát huỳnh quang phát ra chất nhuộm gắn lên một sản phẩm khi sản phẩm này chạy qua một điểm cố định (điểm cố định đồng nghĩa vơi nơi mà hệ thống dò tìm được thiết lập). Trình tự thu được sẽ chuyển vào máy tính để một phần mềm chuyên dụng xử lý kết quả.

Nếu chúng ta đánh dấu cho primer thì tất cả sản phẩm thu được sẽ cùng nhuộm với cùng một thuốc nhuộm, do vậy ta phải sử dụng 4 làn khác nhau. Tuy nhiên, nếu chúng ta đánh dấu cho 4 ddNTP khác nhau với 4 thuốc nhuộm khác nhau thì phản ứng tổng hợp có thể chỉ thực hiện trong 1 ống nghiệm và chỉ cần 1 làn là đủ, như vậy máy sẽ được nâng công suất rất nhiều. Dựa trên cơ sở này mà người ta đã chế tạo nhiều robot tự động đọc các đoạn gene lớn, chẵng hạn như gene người, phần này không đề cập ở đây.

Mặc dù có nhiều điểm khác và giống nhau trong tiến trình đọc trình tự ở cả hai phương pháp thủ công và bằng máy, cả hai phương pháp này gặp phải đều gặp phải một số trở ngại có vẻ gần giống nhau ví dụ như sự hiện diện phân tử DNA có cấu trúc bậc hai (vòng kẹp tóc) có thể gây nhiễu cho quá trình tổng hợp DNA? Do vậy, để giải quyết các lỗi tìm ẩn, người ta phải can thiệp bằng cách thay đổi điều kiện phản ứng; đọc trình tự các mảnh nhỏ khác nhau mà các mảnh này có các vùng gối đầu lên nhau (như các tấm ngói) với những đoạn DNA mà người ta nghi là có vấn đề khi đọc trình tự; hoặc người ta đọc cả hai sợi của DNA thay vì một sợi. Các kết quả thu được sẽ giúp đọc trình tự với độ chính xác cao nhất.



Chúc cuối tuần vui vẻ.
Concay

Chào các bạn ! lâu nay bận quá không vào box được. Đến nay có dịp vào đây và có cảm giác tình hình của box vẫn không có gì đổi mới, xin thành thật chia buồn... và xin có lời cảm ơn user concay vì sự xuất hiện của ông ở đây, nếu không có ông thì có lẽ một thời gian dài (đã qua và có lẽ sắp đến) bà con không có cái gì để mà ''đọc chơi đỡ buồn'' cả.
Tôi chỉ là một thành viên không thường xuyên và chỉ vỏ vẽ đôi ba chữ không dám múa rìu qua mắt thợ nhưng nhân đọc topic ''DNA sequencing'' (hình như đã được gửi từ lâu lắm rồi) tôi có đôi điều trao đổi. Ông viết thế này (xin được trích nguyên văn):
''...thứ hai, việc gắn thêm base lên sợi DNA mới tổng hợp sẽ được thực hiện thông qua việc tạo thành khung phosphoester đồng hóa trị giữa gốc 5?Tphosphate của sợi DNA mới (sợi DNA bị gắn thêm base) và nhóm 3?T-OH của base tự do (tức base sẽ bị kéo vào sợi mới). Cơ chất tham gia phản ứng này chính là một 5?TdNTP, ví dụ một deoxynucleotid có 3 nhóm phosphate ở vị trí 5?T của đường deoxyribose;2 trong số 3 phosphate này sẽ bị loại đi khi phản ứng xảy ra...''. Hình như ở đây có vấn đề vì khung phosphoester đồng hóa trị này được tạo thành bởi gốc 3'-OH (3'hydroxyl) của đường deoxyribose (hoặc ribose) trên sợi đang được replicate và gốc 5'-PO4 (5?Tphosphate) của phân tử (có 1' base) được tiếp tục gắn vào (để kéo dài chuổi polynu). Theo tôi hiểu thì DNA polymerase cần đầu 3'-OH (tự do) để xúc tác chứ không cần đầu 5'-PO4. Chính vì điều này mà chuổi Polynu được kéo dài theo chiều 5'-3' và mới có thể kết thúc ở thằng cụt tay 2?T, 3?T- dideoxy (''đề'' tiếp O ở gốc 3'-OH trong 2?T-deoxy ) trong phương pháp của Sanger được chứ.
Tôi chậm tiêu, nhiều khi không hiểu rõ vấn đề lắm nên ú ớ vài ba câu, chỉ nêu lên một số thắc mắc không dám múa rìu qua mắt thợ. Mong đuọc hiểu rõ hơn.
Chúc sức khoẻ các thành viên! chắc còn lâu nữa mới có thể vào đây chơi vì công việc dạo này rất bận. Mọi người bỏ qua nhé.
Oryza sativa L.

có lẽ tại hạ đã có hứng thú trở lại mà chơi với cái box CNSH này, haaaaaaaaaaaaaaaaaaaa. Ít ra thì phải có những người như Odonata hay Vil chứ, có vậy, mới cảm thấy hứng thú mà ... tung chưởng để ... doạ nhau.
cám ơn ông VIL rất nhiều. Thực sự khi viết bài này, nguyên bản gốc của tôi trong laptop là chính xác, chỉ khi paste len day thì tôi cố tình làm sai cái chi tiết hướng 3´- 5´. Vì đây là cái căn bản trong sinh học đại cương chứ chưa nói là sinh học phân tử hay sinh học hiện đại. Nhưng than ơi, hỡi ơi, trời đất ơi, Tôi ngồi đợi cả tháng mà chẳng thấy có một người nào phát hiện ra cái lỗi sơ đẳng "tày trời" này. Một phần vì ít có thành viên tham gia, phần nữa có lẽ khi đọc cái tiêu đề DNA sequencing người đọc đã cảm thấy loá mắt, nên ... hỉ hả mọi thứ hết.
Yes, điều tôi muốn nói rằng, cho dù là SH hiện đại đến mức độ nào, có CNSH đến mức độ nào, tất cả phải đi lên từ cái nền, cái gốc rất căn bản. Mọi quy trình, protocol hay máy móc tự động làm việc đều dựa trên cái kiến thức cho con người cung cấp. Máy móc càng tinh vi đến đâu thì nó lại cần kiến thức nền tảng nhiều bấy nhiêu.
Còn Ễnh ưỡng hỏi rằng tôi lấy nguồn tư liệu từ đâu à, bạn muốn hỏi cụ thể bài nào??? Có bài thì ở VN đã có sẵn, ví dụ như PCR thì sách VN viết nhiều rồi, còn các bào khác thì tùy.
Chúc một tuần làm việc vui vẻ

Chào concay !
Hôm nay quay lại xem ông nói thế nào về vấn đề tôi đặt ra hôm trước. Quả thật tôi ngượng thay cho sinh viên ngành sinh học ở Việt Nam trên một diễn đàn chuyên môn của ''Trí tuệ Việt Nam'' mà đọc một bài tréo nghoe như thế vẫn gật gù, vui vẻ, hỉ hả để cho rằng mình như thế là ''cập nhật''. Tôi nói điều này mặc dù không muốn nói đến cá nhân tôi cũng đã từng lăn lóc ăn cơm xứ người để bây giờ chê bai gì hết. Nhưng có một thực tế là học sinh cấp 4 của chúng ta bây giờ quá máy móc, và mất gốc rất căn bản trong khi đó lại vì sĩ diện nên làm ra vẽ tiếp cận với kiến thức hiện đại (điều này xét ở một góc độ nào đó thì đáng hoan nghênh nhưng cần phải có một background vững vàng, tôi nói thẳng mong bỏ qua cho). Tuy nhiên tôi cũng muốn nói với ông concay một điều là không nên nắn gân kiểu như thế vì các thành viên ở đây có mặt bằng kiến thức không đồng đều và không khéo lại phát sinh những vấn đề hết sức tế nhị về kiến thức. Kiểu như một ''chú'' đã từng hỏi tôi là ở plant kết quả của meiosis division là gì ? tôi trả lời là in most plants meiosis and fertilization divide the life of the organism into two distinct phases or "generations" (alternation of generations) thì meiosis hình thành spore và từ đây germinate and develop into the gametophyte generation thì chú này kết luận ngay: spore = gamete (lập luận theo kiểu máy móc giảm phân tạo giao tử, mất căn bản và nguy hiểm vô cùng). Nên cho dù đây là diễn đàn phi lợi nhuận và không biết ai để qui trách nhiệm nhưng thiết nghĩ mọi người phải có trách nhiệm trước những điều mình trao đổi. Có như vậy mới mong có được những thông tin chính xác và bổ ích từ diễn đàn này.
Tôi không có ý phê phán gì, chỉ nói thẳng những suy nghĩ mong bạn concay và mọi người thông cảm. Tôi lấy làm tiếc rằng không thể thường xuyên tham gia diễn đàn.
Oryza sativa L.

- Đồng ý với ý kiến của ông Vil về việc nắn gân gì đó.
- Hôm nay vừa đi suối nước nóng về, chả có con chuồn chuồn quái nào chịu nổi nhiệt độ cao, lác đác gặp vài con O. sabina Rừng ở Điện Biên toàn rừng thứ sinh, nếu mọi người không nghiên cứu và khảo sát nhanh ở khu vực này thì chả còn gì trong thời gian tới đâu. Mọi thứ thật tệ hại trong tương lai. Có quá nhiều đập nước đang được hình thành.
Hôm nay vẫn là một ngày vất vả, tất nhiên vẫn có vắt và ruồi vàng, à cả ruồi đen trắng ở khu vực này cũng hút máu. Thật là một ví dụ khá hay ho cho hiện tượng hội tụ tiến hoá, phụ miệng của ruồi và muỗi giống hệt nhau!
Ông Vil dạo này vẫn khoẻ chứ, chúc ông vui vẻ nha! Sắp tới định đi thực đia đâu không?
Thế thôi, về ăn cơm, đói rùi, măm măm...................
Odonata