gene transfer

Gửi Caspermini. tôi dán nguyên văn bài viết về Gene transfer để bạn dựa vô đó mà viết phần các hệ thống chuyển gene động vật. Tôi sẽ gửi cho bạn dạng PDF của file này để dễ dọc.

Như vậy, để viết cho dễ, bạn cứ dựa trên sơ đồ hình 1 để viết:

tức là chia các pp thàhh 3 nhóm: Hóa-lý-sinh học.

trong mỗi nhóm trình bày các pp:

trong mỗi pp phải trình bày cụ thể Ưu khuyết điểm, khả năng ứng dụng.

Ở mỗi pp nếu bạn cần tài liệu cứ nói, tôi sẽ cung cấp cho, OK chứ

Nếu cố gắng hoàn thành trước tháng 12 là Ok. Để tôi chỉnh sửa rồi post lên vào khoảng tháng 1 tới.



Gene Transfer and Expression in Tissue Culture Cells

Pavel S Gromov University of Aarhus, Aarhus, Denmark
Julio E Celis University of Aarhus, Aarhus, Denmark


Gene transfer and expression in cultured mammalian cells comprise a complex of techniques to introduce and express novel genetic material in a variety of eukaryotic cell types in an effort to examine the possible effect of its activity on intracellular processes.




Introduction

Gene transfer technology makes it possible to introduce copies of genes into different cell types and to examine the biological consequences of the expression of these genes in the cells. Many different methods have been developed to introduce and express domestic as well as foreign genes in eukaryotic cells by means o a variety of plasmid vectors as vehicles. There are two major types of DNA transfecftion into cells: transient transfection and stable or permanent transfection. Transient expression of a gene of interest takes place from multiple plasmid copies. Stable transfection is characterized by integrating introduced DNA as a unit via nonhomologous recombination processes into the chromosomal DNA of the target cell. Transient and stable transfection are both achieved by introducing into the cell an expression vector harbouring the cDNA of interest downstream of an appropriate promoter.

Outline of Methods

Transient expression depends on the frequency of DNA uptake, plasmid copy numbers, and the expression level per gene. In most techniques of DNA transfer, 5?"50% of the cells take up a plasmid and express the gene of interest transiently over several days. Analysis of gene function usually requires the establishment of mammalian cell lines that contain the gene of interest in a stable, integrated form. The frequency of DNA integration is rather low (about 1/10 000); therefore, stable transformants are usually selected by their ability to resist cytotoxic antibiotics. Such resistance is provided by a dominant selectable marker gene that is inserted into an expression vector together with the gene to be studied. Following transfection, the cells are allowed to grow under selective con***ions for about 10?"20 days before individual foci can be picked up and expanded into cell lines. See also: Transfection of DNA into mammalian cells in culture; Genetic engineering: reporter genes


Any protocol for gene transfer starts from the design of the transfection vector. In most cases, the DNA construct should contain the DNA insert, containing the initiation codon, a Kozak sequence, and a stop codon for proper expression of the protein in the cell, and a gene that confers resistance to the selective drug (in the case of stable integration). The repertoire of available techniques to deliver exogenous DNA into eukaryotic cells is very wide and can be subdivided into several groups according to the principle underlying the method of transfection: biological, physical, mechanical or chemical (Figure 1).




Figure 1
Methods for gene transfer into mammalian cells. ...




Virus-mediated gene transfer

Virus-mediated DNA delivery is based on the natural process by which viruses infect mammalian cells. Viruses have specific mechanisms for the expression of their genomes, either through maintenance of episomal elements or by integration into the host cell genome. Many viral vector systems are used for gene transfer, including retrovirus, SV40, adenovirus, vaccinia virus, herpesvirus and several others, but retroviral vectors are used most frequently to introduce genes into mammalian cells. See also: Gene delivery by viruses; Retroviral replication


Receptor-mediated gene transfer

DNA to be delivered into mammalian cells is bound to a polylysine?"transferrin conjugate (Wagner et al., 1990). Polylysine, a polycation, binds with DNA molecules and condenses them into small complexes. The ligand transferrin binds to its specific receptor located on the external side of the cell membrane. Subsequently, DNA is taken up into the cell by endocytosis. See also: Clathrin-coated vesicles and receptor-mediated endocytosis


Electroporation

This technique is based on transient permeabilization of cell membranes by pulsed electric fields and is applicable to perhaps all cell types (Herr et al., 1998). A DNA?"cell suspension is subjected to a relatively high electrical impulse that induces local regions of reversible membrane breakdown, generating micropores through which DNA molecules enter the cell. Electroporation has the advantage of successfully delivering both supercoiled and linearized vectors into the cell. Linear DNA with free ends is more recombinogenic and more likely to be integrated into the host chromosome, thus yielding stable transformants. Using a linearized vector for stable integration can significantly increase the probability that the DNA construct will not integrate into the host genome in a way that will disrupt the gene of interest. See also: Electroporation


Laser poring

It has been shown that if cells are exposed to short pulses of a laser beam, small holes are transiently formed in the cell membranes that make it easier for DNA molecules suspended in the surrounding medium to enter the cells (Tao et al., 1987).


Microinjection

Microinjection is based on injection of DNA using glass microcapillaries that penetrate through the cell membrane (Graessmann and Graessmann, 1998). Microinjection is the only method that allows transfer of a known number of DNA molecules into the cell.


Particle bombardment

DNA molecules are packed into tiny microparticles that are accelerated to high velocities (up to 1000 m s^'1) and directly delivered into the cell (Klein et al., 1992). The particle delivery system employs gold, tungsten or ice to form DNA microparticles. See also: Microprojectile bombardment


Calcium phosphate-mediated transfection

In this method, plasmid DNA is introduced into cell cultures via a precipitate with calcium phosphate that adsorbs onto the cell membrane. After adsorption, DNA is taken up by the cell by a calcium-requiring process (Graham and Van der Eb, 1973). This method is probably the least reproducible of the transfection procedures because highly effective precipitates can be obtained in only a very narrow range of finely tuned experimental con***ions (Jordan et al., 1996).


DEAE-dextran-mediated transfection

DNA/DEAE-dextran complexes are prepared in a mixture and added to cells in culture (Lopata, 1984). It is assumed that large complexes containing both DNA and DEAE-dextran attach to the cell surface and are somehow taken up by endocytosis.


Lipofection

Liposome-mediated DNA transfection into cultured cells is based upon ionic interaction of DNA with a polycationic lipid reagent to form a complex that can penetrate the cell membrane by endocytosis (Bichko, 1998; Friend et al., 1996) and thus deliver functional DNA into the cell. See also: Liposomes


Following transfection, direct detection of the gene product can be accomplished with various specific assays for the protein of interest in transfected target cells: immunocytochemistry, ELISA, Western blot analysis, immunoprecipitation, specific enzyme assays and others. See also: Immunohistochemical detection of tissue and cellular antigens; Enzyme-linked immunosorbent assay; Western blotting; Immunoprecipitation techniques; Enzyme activity and assays




Applications

The ability to transfer DNA into eukaryotic cells in vitro provides a means of determining how the overexpression of a specific gene of interest may affect various cellular processes. Gene transfer technology is used for many purposes, including (1) to produce large amounts of proteins that are normally available in very low quantity; (2) to evaluate the effect of specific mutations introduced in genes; (3) to verify the identity of a cloned gene; and (4) to study the physiological consequences of overexpression of a protein of interest prior to advancing to more costly and labour-intensive transgenic models. See also: Gene expression in yeast; Gene expression in plants


It may also be appropriate to express proteins under inducible promoters, particularly if the protein exerts toxic effects on the cell. Different regulatory domains and motifs of a specific gene promoter region can be studied by engineering chimaeric constructs containing a promoter region of interest and a reporter gene, transfecting them into the cell, and monitoring expression of the reporter gene. Stable transfection of embryonic stem cells and microinjection of oocytes are the key steps in the establishment of transgenic and knockout animals. See also: Promoter fusions to study gene expression; Transgenic animals; Knockout and knock-in animals; Microinjection into Xenopus oocytes




Future Developments

The further development of DNA transfer techniques as applied to intact tissues can provide a valuable tool for studying gene regulation directed by heterotypic cell?"cell contacts in complex tissues or organs that cannot be reproduced in primary cell culture. Genetic modifications introduced in the genome of specific human cells can make it possible to produce human cells for transplantation to patients carrying a corresponding deficient mutation. Gene manipulation in a patient?Ts own cells in an attempt to restore gene function can provide an attractive application for gene therapy. It can also be expected that DNA transfer technologies will find further applications in the biopharmaceutical industry and in tissue engineering. See also: Human gene therapy; Pharmacogenetics




Summary

Gene transfer technology represents a broad repertoire of various techniques for introducing novel genetic information into a cell by means of directly delivering exogenous DNA into tissue culture cells. In vitro introduction of copies of genes into different cell types makes it possible to detect the expression of these genes and to examine the physiological consequences of their activity in the cells.




Originally published: July 2000


References

Bichko VV (1998) Cationic liposomes. In: Ravid K and Freshney I (eds) DNA Transfer to Cultured Cells, pp. 193?"212. New York: Wiley-Liss.

Friend DS, Papahadjopoulos D and Debs RJ (1996) Endocytosis and intracellular processing accompanying transfection mediated by cationic liposomes. Biochemica et Biophysica Acta 1278: 41?"50.

Graham FL and Van der Eb AJ (1973) A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA. Virology 52: 456?"467. Links

Graessmann M and Graessmann A (1998) Microinjection of RNA and DNA into somatic cells. In: Celis JE, Carter N, Hunter T et al. (eds) Cell Biology. A Laboratory Handbook, vol. 4, pp. 11?"23. London: Academic Press.

Herr S, Pepperkok R, Saffrich R, Wiemann S and Ansorge W (1998) Electroporation of cells. In: Celis JE, Carter N, Hunter T et al. (eds) Cell Biology. A Laboratory Handbook, vol. 4, pp. 57?"92. London: Academic Press.

Jordan M, Schallhorn A and Wurm FM (1996) Transfecting mammalian cells: optimization of critical parameters affecting calcium-phosphate precipitate formation. Nucleic Acids Research 24: 596?"601. Links

Klein TM, Arentzen R, Lewis PA and Fitzpatrick-McElligott S (1992) Transformation of microbes, plants and animals by particle bombardment. Bio/Technology 10: 286?"291.

Lopata MA, Cleveland DW and Sollner-Webb B (1984) High-level expression of a chloramphenicol acetyl-transferase gene by DEAE-dextran-mediated DNA transfection coupled with a dimethylsulfoxide or glycerol shock treatment. Nucleic Acids Research 12: 5707?"5717. Links

Tao W, Wilkinson J, Stanbridge EJ and Berns MW (1987) Direct gene transfer into human cultured cells facilitated by laser micropuncture of the cell membrane. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 84: 4180?"4185. Links

Wagner E, Zenke M, Cotten M, Beug H and Birnstiel ML (1990) Transferrin-polycation conjugates as carriers for DNA uptake into cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 87: 3410?"3414. Links


Further Reading

Ravid K and Freshney I (eds) (1998) DNA Transfer to Cultured Cells. New York: Wiley-Liss.

Hauser H and Wagner R (eds) (1997) Mammalian Cell Biotechnology in Protein Production. Berlin: Walter de Gruyter.











Concay

Em đã load nguyên cái bài này về rồi, em sẽ ngâm cứu trong thời gian sớm nhất và nếu cần tài liệu gì thì nhất định sẽ phải nhờ đến anh rồi.
Để em đọc đã, có gì sẽ trao đổi với anh sau thé. Thanks
Casper

Đây là bản dịch bài báo của anh Concay, em nghĩ là nếu anh đã có tài liệu về từng hệ thống chuyển gen động vật rồi thì anh chuyển luôn cho em được không ạ, để em đỡ phải tốn công đi tìm, qua đó rút ngắn thời gian lại. Mong sớm nhận được tài liệu của anh.
Em cũng còn một điều nữa không hiểu là anh định để em viết xong hết rồi đưa anh sửa rồi post lên hay là em sẽ viết từng hệ thống chuyển gen rồi đưa anh sửa và post lên luôn. Không biết thế nào tiện cho anh hơn ạ, em thì sao cũng được hết. Còn một điều nữa là chỗ nào anh sửa cho em, anh có thể bớt thêm một chút thời gian bằng việc sửa sang bên cạnh hay cho vào trong ngoặc hay đánh dấu đỏ vào để em có thể biết chỗ nào mình còn sai, qua đó lần sau em sẽ rút kinh nghiệm và anh cũng đỡ tốn thời gian sửa không ạ.
Tôi cũng mong các thành viên khác trong diễn đàn góp ý để các bài viết cũng như các chủ đề có chất lượng hơn. Cảm ơn.
Chuyển gen và biểu hiện gen trong mô tế bào
Pavel S Gromov University of Aarhus, Aarhus, Denmark
Julio E Celis University of Aarhus, Aarhus, Denmark
Biểu hiện gen và chuyển gen trong tế bào động vật gồm các kỹ thuật phức tạp đưa vào và biểu hiện các gen mới trong các tế bào eukaryotic khác nhau nhằm nghiên cứu hiệu quả hoạt tính của nó trong các quá trình nội bào.
Giới thiệu chung
Kỹ thuật chuyển gen có thể đưa bản sao của gen vào các dạng gen khác và nghiên cứu kết quả sinh học của sự biểu hiện các gen này trong tế bào.
Một số phương pháp khác nhau đã được phát triển để đưa và biểu hiện các gen nội cũng như ngoại tế bào eukaryotic với phương tiện là các vector plasmid. Có hai cách chuyển gen quan trọng vào tế bào: chuyển gen nhất thời (transient transfection ) và chuyển gen vĩnh cửu (stable or permanent transfection). Biểu hiện gen nhất thời xảy ra thí bị từ các bản sao đa plasmid (multiple plasmid copies). Chuyển gen vĩnh cửu có tính chất hoà nhập (integrating) của DNA được đưa vào như một đơn vị theo quá trình tái tổ hợp tương đồng trong DNA của nhiễm sắc thể tế bào đích. Chuyển gen nhất thời và vĩnh cửu đạt được bằng cách đưa vào tế bào một cDNA chứa vectơ biểu hiện của promoter xuôi dòng thích hợp (interest downstream of an appropriate promoter).
Nguyên tắc chung của phương pháp (Outline of Method)
Sự biểu hiện nhất thời phụ thuộc vào tần suất của DNA hấp thụ, số bản sao plasmid, và mức độ biểu hiện của mỗi gen. Trong hầu hết các kỹ thuật chuyển DNA, 5?"50% tÕ bµo hấp thụ plasmid và biểu hiện gen nhất thời sau một vài ngày. Việc phân tích gen chức năng thường cần thiết lập các dòng tế bào động vật chứa gen ổn định có dạng hoà nhập. Tần suất hoà nhập của DNA thường thấp hơn (khoảng 1/10 000); do đó chuyển gen vĩnh cửu thường đượng lựa chọn bởi khả năng các kháng sinh kháng độc của chúng (resist cytotoxic antibiotics). Tính kháng này được cung cấp bởi gen có tính trội lựa chọn (dominant selectable marker gene), thích hợp cho vectơ biểu hiện cùng với gen nghiên cứu. Sauk hi chuyển, các tế bào được phát triển dưới các điều kiện lựa chọn trong 10?"20 ngày trước khi ổ bệnh riêng có thể tăng lên và bung nổ trong các dòng tế bào.
Bất cứ cách chuyển gen nào đều bắt đầu từ việc thiết kế vectơ chuyển. Trong hầu hết các trường hợp, cấu trúc DNA có thể giữ lại DNA gắn, chứa bộ ba khởi đầu (initiation codon), trình tự Kozak, và bộ ba kết thúc (stop codon) để biểu hiện thích hợp protein trong tế bào, và mộ gen kháng thuốc lựa chọn.(selective drug) (trong trường hợp hoà nhập vĩnh viễn (stable integration). Có rất nhiều phương pháp phân phối DNA ngoại sinh vào tế bào eukaryotic, có thể chia thành một số nhóm theo bản chất của phương pháp chuyển: sinh học, vật lý, hoá học
Hình 1: Các phương pháp chuyển gen vào tế bào động vật ...
Chuyển gen kết hợp với virut:
Phân phối DNA kết hợp với virut có cơ sở là các quá trình lây nhiễm tự nhiên của virut vào tế bào động vật. Virut có cơ chế đặc hiệu cho sự biểu hiện trong bộ gen của chúng, hoặc thong qua các thể episomal hoặc hoà nhập với bộ gen của tế bào chủ. Một số hệ thống vectơ virut được sử dụng để chuyển gen gồm các retrovirus, SV40, adenovirus, vaccinia virus, herpesvirus và một số dạng khác, nhưng vectơ retrovirut được sử dụng nhiều nhất cho mục đích chuyển gen vào tế bào động vật.
Chuyển gen kết hợp với thể nhận (Receptor-mediated gene transfer)
DNA để đưa vào tế bào động vật DNA được bao trong polylysine?"transferrin conjugate (Wagner và cộng sự., 1990). Polylysine, a polycation, gắn với các phân tử DNA và kết tụ chúng thành một phức hệ nhỏ (small complexes). Ligand transferrin gắn với receptor đặc hiệu của nó nằm ngoài màng tế bào. Kết quả là DNA được hấp thụ vào trong màng tế bào bằng endocytosis.
Tạo lỗ hổng điện từ (Electroporation)
Kỹ thuật này dựa trên độ nhiễm từ nhất thời (transient permeabilization) của màng tế bào bởi các trường điện xung động (pulsed electric fields) và chắc chắn có thể ứng dụng trên tất cả các dạng tế bào. (Herr và cộng sự, 1998). DNA dạng huyền phù của tế bào (DNA?"cell suspension) bị đưa vào vùng điện trường kích thích gây ra các vùng cục bộ, màng tế bào bị vỡ, tạo ra các vi lỗ thông qua đó, các phân tử DNA vào tế bào. Tạo lỗ hổng điện từ có thể phân phối thành công các vectơ dạng siêu xoắn và dạng thẳng vào trong tế bào. DNA mạch thẳng với các đầu tự do dễ kết hợp với bộ gen và dễ hoà nhập với nhiễm sắc thể của vật chủ hơn, do đó thuận lợ trong chuyển gen vĩnh cửu. Sử dụng các vectơ dạng mạch thẳng để chuyển gen vĩnh cửu có thể tăng đáng kể khả năng cấu trúc DNA sẽ hoà nhập vào bộ gen chủ theo cách phá vỡ gen mong muỗn.
Tạo lỗ laze (Laser poring)
Nếu tế bào tiếp xúc với các xung laze ngắn sẽ tạm thời tạo thành các lỗ nhỏ trên màng tế bào. Điều này làm các phân tử DNA dạng dễ dàng neo bám trong môi trường xung quanh để vào tế bào (Tao và cộng sự, 1987).
Vi tiêm (Microinjection)
Vi tiêm có cơ sở là tiêm DNA sử dụng các vi ống thủy tinh (glass micro capillaries) xuyên qua màng tế bào (Graessmann và Graessmann, 1998). Vi tiêm chỉ là phương pháp cho phép chuyển các phân tử DNA đã biết số lượng vào tế bào.
Bắn hạt (Particle bombardment)
Các phân tử DNA được ?ogói? trong vi hạt làm tăng tốc độ (đến 1000 m.s^'1) và trực tiếp phân phối vào tế bào (Klein et al., 1992). Hệ thống phân phối hạt bao gồm vàng, tungsten hoặc đá từ dạng vi hạt của DNA.
Chuyển gen kết hợp với Calcium phosphate
Trong phương pháp này, DNA plasmid được đưa vào tế bào cùng với sự kết tủa của calcium phosphate hút bám (adsorb) trên màng tế bào. Sau sự hút bám, DNA được hấp thụ bởi tế bào bằng các quá trình cần canxi (calcium-requiring process) (Graham và Van der Eb, 1973). Phương pháp này có khả năng thành công ít nhất do hiệu quả kết tủa cao chỉ được thấy trên một vùng rất nhỏ theo điều kiện thí nghiệm (Jordan et al., 1996).
Chuyển gen kết hợp với DEAE-dextran
Phức hợp DNA/DEAE-dextran được chuẩn bị trong hỗn hợp và cho vào trong canh trường tế (Lopata, 1984). Có giả thiết là các phức hệ lớn chứa cả DNA và DEAE-dextran gắn với bề mặt tế bào và bằng cách này được hập thụ bởi endocytosis.
Lipofection
Chuyển gen kết hợp với Liposome trong canh trường tế bào có cơ sở là tương tác ion đồng thời của DNA với chuỗi chất béo tích điện dương (polycationic lipid reagent) tạo thành phức hệ có thể xâm nhập vào màng tế bào bằng endocytosis (Bichko, 1998; Friend và cộng sự, 1996) và sau đó phân phối DNA chức năng vào tế bào .
Sau khi chuyển gen, có thể tìm sản phẩm gen trực tiếp với các thí nghiệm đặc hiệu khác nhau, nhằm xác định protein mong muốn có được chuyển tới các tế bào đích hay không: immunocytochemistry, ELISA, Western blot analysis, immunoprecipitation, các thí nghiệm enzim đặc hiệu và các thí nghiệm khác.
Ứng dụng
Khả năng chuyển DNA tới các tế bào eukaryotic in vitro cung cấp cách xác định gen đặc hiệu biểu hiện và tác động như thế nào trong các quá trình tế bào khác nhau. Kỹ thuật chuyển gen được sử dụng cho một số mục đích bao gồm: (1) tạo ra một lượng lớn các protein mà bình thường chúng được tạo ra rất ít; (2) đánh giá hiệu quả đột biết đặc hiệu trong các gen; (3) xác định tính đồng nhất của gen tách dòng; (4) nghiên cứu kết quả sinh lý của sự biểu hiện các protein có giá cao và mẫu chuyển gen chuyên sâu trong phòng thí nghiệm
Nó cũng có thể thích hợp với các protein biểu hiện dưới các promoter có thể điều khiển, đặc biệt nếu protein sử dụng hiệu quả độc tính trong tế bào. Các vùng điều hoà khác nhau và các motif promoter đặc hiệu gen có thể được nghiên cứu bằng kỹ thuật cấu trúc chimaeric chứa vùng promoter của gen mong muốn và gen báo cáo (reporter gene), chuyển chúng tới tế bào và giám sát sự biểu hiện của gen báo cáo. Chuyển gen vĩnh cửu của các tế bào mầm phôi thai (embryonic stem cell) và vi tiêm của noãn bào (oocytes) là các bước quan trọng trong sự thiết lập chuyển gen và gây mê động vật.

Các phát triển trong tương lai
Các phát triển trong tương lai của kỹ thuật chuyển DNA cũng như ứng dụng với các mô nguyên vẹn (intact tissues) có thể cung cấp công cụ hữu hiệu cho nghiên cứu sự điều hoà gen trực tiếp bởi heterotypic cell?"cell tiếp xúc trong phức hệ mô hay cơ thể, cái không thể tạo ra trong canh trường tế bào đầu tiên. Đưa các biến đổi di truyền vào bộ gen của các tế bào người đặc hiệu có thể tạo ra các tế bào người để cấy ghép vào người bệnh mang đột biến thiều hụt tương ứng. Thao tác gen trên tế bào của người bệnh với mục đích phục hồi gen chức năng có thể cung cấp ứng dụng hấp dẫn cho liệu pháp gen. Cũng có thể mong chờ các kỹ thuật chuyển DNA sẽ tìm thấy các ứng dụng tương lai trong công nghiệp dược sinh học (biopharmaceutical industry) và kỹ thuật mô.
Casper