Hỏi đáp về PCR - rất mong được mọi người giúp đỡ !

Hỏi đáp về PCR - rất mong được mọi người giúp đỡ !

Bác Con_Cay và các bác thành viên Box CNSH thân mến, em thấy các bác bàn tán nhiều về tất cả mọi mặt của CNSH. Em trình độ thấp không dám tham gia trao đổi kiến thức, thú thật là vì sợ mình lộ cái dốt ra ngoài, sợ các bác chê cười. Nhưng hôm nay em quyết định lấp lỗ hổng kiến thức của mình bằng cách vào đây lập một topic, mong đưọc các bác chỉ giáo cho những điều còn chưa hiểu biết rõ, để em bớt đi được phần nào những lỗ hổng kiến thức của bản thân.

Vài lời rất chân thành, mong các bác hiểu.


Trước hết em xin hỏi, trong một quy trình PCR em thấy có hai loại, loại 1 thì ở phần chính (lặp lại nhiều chu kỳ) có ba giai đoạn là: Denaturing, annealing, và enlongation (em không nhỡ rõ nên lắp từ hơi lộn xộn). Nhưng em thấy một số quy trình lại chỉ có 2 chu kỳ là Denat. và Anneal. + Enlong. nghĩa là vừa bắt cặp mồi, vừa tổng hợp. Cái này thì với kiến thức của em, em không hiểu tại sao Taq có thể làm thế được ??? Mong đưọc chỉ giáo !!!!


Em sẽ còn hỏi nhiều, mong được sự quan tâm của các bác. Em chân thành cám ơn !!!!




hahaha

Thiet tinh la toi khong hieu may cau hoi cua ban. Ban co the cho vi du cu the mot chuong trinh PCR nhu vay cho moi nguoi tham khao khong?
Everything has two sides or more.

quả thật tôi cũng chẳng hiểu nổi bạn định hỏi cái gì nên khó trả lời được; nhưng tôi đoán là bạn đề cập đến PCR thông thường và PCR để chạy đọc trình tự???? Tốt nhất là bạn nên cho ví dụ cụ thể, bạn gặp nó ở đâu?? Con rùa cụt đuôi kia sẽ trả lời giúp bạn vì con rùa là chuyên gia PCR đó.
Concay

HI Trang198,
Khi Tm của primers được thiết kế trong khoảng từ 68-74oC thì có thể gộp 2 bước annealing và enlongation vào làm một.
Thực sự PCR trong trường hợp này vẫn gồm đủ 3 steps. Taq polymerase chỉ làm nhiệm xúc tác để tạo các sợi DNA mới.
Chú ý khi dùng annealing và enlongation cùng 1 nhiệt độ thì nhớ tăng thời gian so với enlongation bình thường.
Tăng thời gian chính xác bao nhiêu thì còn tuỳ thuộc vào máy PCR bạn đang dùng.
Hope it can help u.

i love vn

Em hiểu rồi ạ, có điều em hỏi ngô nghê quá phải không ạ. Lẽ ra phải hỏi "em không hiểu MỒI phải hoạt động như thế nào? " lại hỏi "Taq hoạt động như thế nào " . Mong các anh lượng thứ !


Em hỏi thêm một câu nữa ạ !
Theo một tài liệu có nói Để giảm bớt các sản phẩm không đặc hiệu ngắn (băng phụ phía dưới) thì nên giảm nồng độ KCl xuống và giữ nguyên [MgCl2] hoặc có thể tăng [MgCl2] lên tới 3-4,5mM và giữ nguyên nồng độ dNTP.
Nguyên lý của quá trình này như thế nào ạ, em hỏi để lấy hướng tìm hiểu tiếp, em không muốn cứ máy móc làm theo mà chẳng biết tại sao nó thế.......
Em cũng biết là tăng hoặc giảm cofactor của mồi hay Taq thì sẽ chỉnh PCR theo hướng mình muốn, nhưng cụ thể thế nào thì em không rõ....


Cám ơn các anh nhiều, mong được giúp đỡ !

De loai bo hoac giam cac PCR products ko mong muon, thong thuong nen tang annealing temperature len vai do C (nen thu khoang 4 che do khac nhau: +2, +4, +6 va +8 do C so voi nhiet do dang su dung. MgCl2 nen dung la 1.5 mM voi Taq polymerase. dNTPs = 200microM.
Neu extra bands van con thi nen dung hot start PCR.
Cung co the giai quyet van de tren = cac loai polymerase khac nhu Pfu, Vent, Gold Taq ...
Neu cac phuong an tren van ko lai hieu qua thi nen xem viec thiet ke primer (viec nay thuc ra la quan trong nhat de co duoc PCR product dung nhu mong muon)
Ngoai ra do tinh sach cua DNA template, nuoc dung cho PCR va chat luong cua primers (hang san xuat, tinh sach?)cung anh huong den ket qua PCR
Good luck!

i love vn

Anh nói rõ hơn về Hot start được không ạ ? Em đọc tài liệu cũng chưa hiểu rõ lắm, chắc là vì vốn tiếng Anh còn kém quá !

Hot start la ko tron Taq polymerase ngay vao PCR mix truoc khi chay PCR, ma cho Taq vao PCR mix sau Denat. step va truoc anneal. step o cycle dau tien.

i love vn

Dieu nay ban noi gan dung, neu ANNEALING temp (chu khong phai Tm) trong khoang nhiet do cua elongation thi 2 buoc nhap lai mot duoc.
Nhung cung can them rang, neu annealing temp ma nho hon elongation temp, va neu san pham PCR rat la ngan, thi du khoang chung 100 bp, thi co the khong can elongation step. Boi vi trong qua trinh tang nhiet do tu annealing temp den denaturing temp, nhiet do cung da di qua khoang 68-74oC chi trong vai giay va no cung du thoi gian de Taq enzyme tao thanh san pham
than,
ires

To ires,
Khi thiet ke primers thi dung khai niem Tm
Khi noi ve PCR cycling parameters thi dung Ta (aneal. temp.)

i love vn

Được cbnu sửa chữa / chuyển vào 08:14 ngày 30/10/2003