Hỏi đáp về PCR - rất mong được mọi người giúp đỡ !

Cho em hỏi thêm với.


Khi em có một cặp mồi đã biết rõ trình tự, em có thể so sánh nó với genome để tìm ra trình tự của đoạn nằm giữa như thế nào ạ !

Dùng BLaST nghĩa là thế nào, em chưa hiểu ...
Mong được các anh chỉ giúp !

hahaha

Bạn vui lòng viết câu hỏi rõ ràng hơn 1 chút.
Ý câu hỏi của bạn là: khi bạn có trình tự của primers, bây giờ bạn sẽ so sánh với genome để tìm ra đoạn gene nằm giữa chứ gì, và ý bạn hỏi là làm thế nào để thực hiện công việc này hay là làm như vậy có được không.
Trên nguyên tắc là khi thiết kế primer người ta phải biết trước trình tự của gene cần chạy PCR, như vậy đương nhiên bạn đã biết trình tự rồi, còn tìm gì nữa. Tuy nhiên cũng có trường hợp khác, tôi sẽ lấy ví dụ cụ thể để bạn dễ hiểu hơn.
Gene A là 1 gene hiện diện ở hầu hết sinh vật sống, tuy nhiên trình tự của gene này trong từng loài sinh vật khác nhau lại không hoàn toàn giống nhau, nó khác nhau có thể ít hoặc nhiều ở một vài vị trí nào đó, nhưng có những vùng không bao giờ bị biến đổi, người ta gọi là vùng bảo tồn. Bằng cách này hay cách khác người ta đã giải trình tự của gene A này ở nhiều loài khác nhau. sau đó người ta sắp sếp các gene này lại để so sánh chúng. Khi so sánh sẽ xuất hiện vùng bào tồn như tôi nói và vùng có thể biến đổi, tức là ở gen A của loài này có thể là T nhưng loài khác lại là C. Dựa trên vùng bảo tồn, người ta sẽ thiết kế cái gọi là "mồi phổ quát". Dùng các cặp mồi này, tôi có thể dùng để dò tìm gene A trong bất kỳ sinh vật nào tôi quan tâm. Nếu khi chạy PCR, kết qủa là dương tính thật thì kết luận là loài nghiên cứu có gene A; nếu âm tính thật thì chưa vội kết luận gì cả. Trong trường hợp dương tính thật, tức là có gene A tôi muốn tìm kiếm; tôi sẽ lấy gene A của loài nghiên cứu đem giải trình tự; khi có trình tự rồi, tôi cũng lại đem so sánh với trình tự gene A của những loài đã có trước đó, chắc chắn tôi cũng sẽ tìm thấy vài điểm khác biệt trong trình tự.
Như vậy, nếu bạn có 1 gene A của 1 loài nhất định nào đó, bạn thiết kế primer để dò tìm gene A của chính loài này thì đương hiên trình tự bạn đã biết, bạn đâu phải thắc mắc gì nữa.
nhưng nếu bạn dùng primer phổ quát để dò tìm gene A trong genome của 1 loài bất kỳ nào đó (giả định gen A của loài này chưa được giải trình tự) thì bắt buộc bạn phải giải trình tự.
Còn trường hợp có người "đánh đố" bạn dưa cho bạn 1 cặp primer nào đó vào bảo rằng: đây là primer của gene A của loài XYZ nào đó (xyz phải được xác định) hãy đi tìm gene A này, thì cách giải quyết có thể có mấy hướng sau:
01. nếu genome của loài xyz đã được giải trình tự đầy đủ thì có thể dùng công cụ bioinformatics để dò tìm, tức là dùng BLAST.
02. nếu genome của loài xyz chưa được giải trình đầy đủ (nhiều loài SV có nhiều gene được giải trình rời rạc chứ genome thì chưa) thì áp dụng như tôi nói, tức là thả primer cho chạy PCR để chắc chắn là dương tính thật, nếu là dương tính thật thì tách sản phẩm PCR dem giải trình tự, có trình tự rồi thì đem trình tự này dò tìm trong GeneBank để phỏng đoán đó là gene gì.
03- nếu bạn chạy PCR ra âm tính giả thí đừng có vội kết luận là gene A không tồn tại trong genome của loài xyz này vì có thể là gene A này đang trên đường suy thoái hay trở thành gene giả, tức là nó bị phát tán tùm lum trong genome. Trong trường hợp này, tình hình có vẻ phức tạp hơn nhưng vẫn có cách giải quyết.
Thân
Concay

Cám ơn anh nhiều...

Em có một đôi mồi, làm theo một bài báo tham khảo, biết rõ locus đó tên chi rồi, nhưng không biết rõ trình tự của nó (người ta dấu), em cũng biết là nó có độ dài cụ thể là bao nhiêu, nhưng trình tự thì em không biết. Đó là điều một khiến em phải gửi câu hỏi tới mấy anh.

Em cũng muốn hỏi là nếu mình đã thiết kế một đôi mồi dựa trên trình tự đã biết của một đoạn gen, em sợ nó sẽ bắt cặp tùm lum với một vị trí khác trong genome của loài đó (loài đã được sequencing genome rồi, VD human chẳng hạn ) và như thế quá trình PCR của em sẽ diễn ra với hiệu suất không được ổn. Nếu mình sử dụng trình tự mồi đó, so với toàn thể genome để rút ra kinh nghiệm mà lùi lên hay dịch xuống một đoạn, thì em nghĩ là tốt hơn - cái này em chưa biết cách. Đó là điều thứ hai khiến em gửi câu hỏi tới anh.

Với lại nếu mình tách đoạn mình cần ra sau khi điện di, rồi thu hồi DNA, sau đó sequencing thì sẽ biết ngay trình tự. Nhưng anh ơi, ở VN nhiều lúc không có điều kiện để làm như vậy đâu.

Tiện đây anh hướng dẫn em sử dụng chương trình BLAST để dò tìm được không ạ, em mới chỉ đọc tài liệu để biết vậy, chứ trên thực tế em hoàn toàn không biết gì...

MOng được các anh giúp đỡ, mong được học hỏi nhiều !

hahaha

[/quote]
Cám ơn anh nhiều...

Em có một đôi mồi, làm theo một bài báo tham khảo, biết rõ locus đó tên chi rồi, nhưng không biết rõ trình tự của nó (người ta dấu), em cũng biết là nó có độ dài cụ thể là bao nhiêu, nhưng trình tự thì em không biết. Đó là điều một khiến em phải gửi câu hỏi tới mấy anh.

Em cũng muốn hỏi là nếu mình đã thiết kế một đôi mồi dựa trên trình tự đã biết của một đoạn gen, em sợ nó sẽ bắt cặp tùm lum với một vị trí khác trong genome của loài đó (loài đã được sequencing genome rồi, VD human chẳng hạn ) và như thế quá trình PCR của em sẽ diễn ra với hiệu suất không được ổn. Nếu mình sử dụng trình tự mồi đó, so với toàn thể genome để rút ra kinh nghiệm mà lùi lên hay dịch xuống một đoạn, thì em nghĩ là tốt hơn - cái này em chưa biết cách. Đó là điều thứ hai khiến em gửi câu hỏi tới anh.

Với lại nếu mình tách đoạn mình cần ra sau khi điện di, rồi thu hồi DNA, sau đó sequencing thì sẽ biết ngay trình tự. Nhưng anh ơi, ở VN nhiều lúc không có điều kiện để làm như vậy đâu.

Tiện đây anh hướng dẫn em sử dụng chương trình BLAST để dò tìm được không ạ, em mới chỉ đọc tài liệu để biết vậy, chứ trên thực tế em hoàn toàn không biết gì...

MOng được các anh giúp đỡ, mong được học hỏi nhiều ![/size=3]

hahaha

[/quote]
01- điều đầu tiên mà tôi khuyên bạn đó là cân nhắc thật kỹ lưỡng để viết câu hỏi cho rõ ràng. bạn viết câu hỏi không rõ ràng thì không ai hiểu hì hết mà không hiểu thì họ chẳng quan tâm và trả lời. Như cái câu hỏi trước, tôi phải suy luận điều bạn muốn hỏi ra mấy trường hợp và trả lời luôn cả cho mấy trường hợp, may mà trúng được một.
02. Những câu hỏi của bạn tôi sẽ lần lượt giúp bạn như sau:
Mục đích chạy PCR của bạn là để làm gì? nếu để tìm kiếm gene bạn quan tâm thì bạn đâu cầu biết trình tự làm gì. ví dụ để chẩn đoán là bệnh nhân có nhiễm HBV hay không thì người ta chỉ cần cho chạy PCR với cặp mồi đặc hiệu , kết qủa dương tính sẽ xác định bệnh nhân đó có thực sự nhiễm HBV hay không. nếu làm theo hướng này thì hoàn toàn bạn không cần phải quan tâm đến toàn bộ trình tự đoạn gene mà mồi sẽ bắt cặp. Như thế khi công bố bài báo, người ta đâu cần công bố trình tự làm gì, có gì mà phải giấu.
việc thiết kế mồi và công bố nó trên tạp chí là 1 việc làm đã được cân nhắc tính toán. nếu họ chạy tốt thì có thể mình cũng chạy tốt (khoảng trên 60% là như vậy), nay mình chạy lại thì mình phải coi lại tecniques tai nghề của mình rồi hãy nói rằng mồi đó chạy được hay không được. Còn việc bạn bảo là thiết kế mồi lùi lên hay dịch xuống đó chỉ là phát biểu có tính cảm tính của bạn.
bạn sợ rằng mồi của bạn bắt cặp tùm lum trên genome là một lo lắng không có căn cứ. nếu không nói là bạn chưa biết gì về lý thuyết genome. Ta có 4 nucleotide CATG, như vậy mỗi vị trí trên DNA sẽ có 4 khả năng xảy ra ( hoặc C hoặc A hoặc T hoặc G); như vậy nếu tôi có 1 đoạn DNA nào đó dài 20 nu thì khả năng tôi sẽ có là
4.4.4.4..... tức là 4 luỹ thừa 20 đoạn DNA dài 20 nu khác nhau.
Bộ gene của người khoảng 3,4 tỷ bp, thì con số 4 mũ 20 là con số vô cùng lớn, sẽ chẳng thể nào có 2 hay nhiều đoạn 20 nu giống y chang để mồi bắt vào đâu. Nói cách khác, chỉ có 1 đoạn trình tự 20 nu duy nhất trên genome người mà primer của bạn có thể bắt vô.
Còn về chuơng trình BLAST thì bạn chịu khó vào trang web NCIB để xem, tôi không thể chỉ dẫn trên này cho bạn được vì quá dài dòng. Nó không khó đâu.
Thân
Concay

To Trang:
Cai gi ma pcr dich len dich xuong, doc qua cau hoi cua ban cung lam cho toi nhuc dau luon. Bao hai bac con Cay phai giai thich toi luon nhieu lan moi trung vo y cua ban!
Toi doan la khi ban biet trinh tu cua cap primer, ten cua gene (ban goi la locus?) thi ban da co the di tim trinh tu cua cai gene o giua cai cap primer nay duoc roi. Cu len NCBI roi search nucleotide, danh vao cai ten gene cua ban (ban goi la locus do) thi no se ra cai trinh tu thoi. Con neu biet cai trinh tu nay co hay chua o tren genbank (NCBI) thi ban phai noi ro ten cua no la gi thi moi nguoi se chi ngay ra cho ban la cai nay da co giai trinh tu chua. Khi ban dat cau hoi.
Ban muon blast cai primer cua ban de tim cai trinh tu cua cai gene ma ban muon thi cung duoc nhung ma khong ai lam nhu vay ca khi da biet ten cua cai gene do. Ban noi la ban khong hieu Blast la gi nen ban dat cau hoi khong hop ly thi cung khong co ngac nhien cho lam. Blast la mot chuong trinh de so sanh mot doan trinh tu cua ban (co the la trinh tu dna hay protein) voi tat ca nhung trinh tu khac trong genbank (hay trong sub-genbank, tuy ban chon). Ket qua cua Blast la tat ca nhung trinh tu co su tuong duong tu cao den thap (that giong = 100% identical, hoi giong hoac tuong tu, <100% identity) voi cai trinh tu cua ban. Ban phai len website nay lam thu thi moi hieu nhung cong dung khac nhau cua Blast.
Trong tuong lai, cho nhung cau hoi tuong tu, toi de nghi ban dat cau hoi theo cach nhu sau thi se co cau tra loi that nhanh chong:
- em muon biet trinh tu cua gene A nhung ma doc bao thi thay nguoi ta chi cho trinh tu cua cap moi cho gene A. Vay lam sao de biet duoc trinh tu cua gen nay?
Con neu ban co cach giai quyet cua ban thi cung nen noi ro hon:
- theo cach cua em thi em se dung cai trinh tu nay, pcr cai gene A, phan tach no ra bang dien giai, roi sequence no. Lieu co cach nao ngan hon de biet trinh tu gen A khong ma em khong phai lan lon vao phong lab lam mat thi gio qui bau cua em?
Dai khai la nhu vay, di nhien theo cau van cua ban, thi nguoi doc se de hieu hon ban dang muon lam gi hay hoi gi.
Chi tru truong hop ban muon choc gian bac con Cay de bac tung ra nhieu tuyet chieu khac neu khong trung cho nay thi cung bo ich tum lum cho khac thi cung tien qua!! hehe...he.
MOng nhan them nhieu cau hoi "hoc bua" cua ban.
Chuc co nhieu ket qua,
I

Mình ko đọc hết mấy câu hỏi của bạn. Nhưng có biết một số web bạn có thể tham khảo để dùng Blast search:
www. cmbi.kun.nl
Trang web tren co'' ca SRS de ban co'' the search them thong tin ve protein or nucleotide sequences, vv.... Dựa trên sequence tim được ban mới có thể thuc hien search bằng Blast, mục đich là để tìm kiếm related sequences in database. Co'' thể từ nucleotide sequence để tìm protein sequence related or ngược lại tuỳ vào mục đích của bạn.
Tuy nhien web tren ko đươc up to date, nhưng vẫn có lots of information bạn có thể tham khảo để biết thêm về bioinformatics và searching tools.
Bạn có thể vào google search: SRS, DBGET or NCBI... chắc chắn sẽ tìm được những phần mềm phục vụ cho mục dích học tập của bạn và rất handy nữa...
Rất vui nếu có thể giúp bạn được.
Happiness lies for those who cried, for those who are hurt, for those who have searched and for those who tried...