Liệu pháp gen trong điều trị HIV

Liệu pháp gen trong điều trị HIV

I. Liệu pháp gen là gì?
A. Giới thiêụ chung:

Vào ngày 14-9-1990, nhóm nghiên cứu tại học viện sức khỏe quốc gia của Mỹ (U.S.National Instituse of Helth) đã tiến hành chuỗi thử nghiệm liệu pháp gen đầu tiên cho bé Ashanti Desilva 4 tuổi. Sinh ra với căn bệnh di truyền hiểm nghèo có tên là sự thiếu hụt miễn dịch tổ hợp m?nh liệt (severe combined immune deficiency SCDI), cô bé thiếu hệ thống miễn dịch và có thể bị tổn thưng khi mắc phi bất kỳ mầm bệnh nào. Những đứa trẻ mắc bệnh này thường không chống lại được sự lây nhiễm và rất khó sống đến tuổi trưởng thành, tuổi th của chúng luôn mắc bệnh tật. Ashanti được lập một hành lang bảo vệ xung quanh, không tiếp xúc với những người ngoài gia đình, trong môi trường vô trùng tại nhà và được điều trị thường xuyên với kháng sinh liều cao.

Trong thủ tục liệu pháp gen của Ashanti, bác sĩ đã loại bỏ các tế bào máu trắng ra khỏi c thể cô ta, cho chúng phát triển trong phòng thí nghiệm, chèn gen thiếu vào các tế bào này và sau đó chuyển tế bào đã được biến đổi di truyền trở lại máu của bệnh nhân. Những kiểm tra trong phòng thí nghiệm đã cho thấy liệu pháp này đã làm tăng hệ thống miễn dịch của Ashanti, cô ta không bị cảm lạnh trở lại, có thể đến trường và đã miễn dịch với chứng ho. Thủ tục này không phi là một phương thuốc, những tế bào máu trắng được xử lý về mặt di truyền chỉ làm việc trong một vài tháng và quá trình này phi lặp lại.

Mặc dù sự gii thích đơn giản này của liệu pháp gen nghe như có kết quả khả quan, nhưng nó mở đầu cho một cuộc tranh luận kéo dài; con đường để liệu pháp gen được chấp nhận là không vững chắc và đầy những cuộc tranh luận. Liệu pháp gen sinh học ở người là rất phức tạp, một số công nghệ cần được phát triển và những căn bệnh cần được hiểu biết cặn kẽ hơn trước khi liệu pháp gen có thể được sử đụng một cách thích đáng.
Tuy nhiên, không thể phủ nhận rằng, ngày nay liệu pháp gen là một lĩnh vực khổng lồ với cơ hội sinh lời lớn cho các nhà đầu tư có hiểu biết. Bằng chứng là sự phát triển của các nghiên cứu về liệu pháp gen trong hơn một thập kỷ qua. Lĩnh vực này có tiềm năng vô cùng to lớn, một số người đã so sánh tiềm năng đầu tư trong công nghệ sinh học đặc biệt là liệu pháp gen với kinh nghiệm trong lĩnh vực công nghệ những năm 1980.
Các gen điều khiển toàn bộ cấu trúc và chức năng của các tế bào cũng như các mô khác nhau trong cơ thể người. Những bệnh phá vỡ các quá trình bình thường này của chúng, do đó, tất cả các bệnh di truyền có thể được thao tác và sử dụng để điều trị và chuẩn đoán người bệnh. Đây là cơ sở của tất cả các sản phẩm liêụ pháp gen.

B. Liệu pháp gen và các bước cơ bản trong liệu pháp gen

1. Định nghĩa:
Trong các ứng dụng của sinh học phân tử vào y học, liệu pháp gen đối với các rối loạn di truyền mở ra nhiều triển vọng nhất, đồng thời cũng là hướng ứng dụng khó thực hiện nhất. Các định nghĩa về liệu pháp gen được thay đổi theo thời gian, ngày nay không có định nghĩa chung nào được chấp nhận cho khái niệm này. Song định nghĩa sau đây được sử dụng rộng rãi nhất trên các diễn đàn Quốc tế.

Định nghĩa: liệu pháp gen là kỹ thuật đưa gen lành vào cơ thể thay thế cho gen bệnh hay đưa gen cần thiết nào đó thay vào vị trí gen bị sai hỏng để đạt được mục tiêu của liệu pháp.

- Biện pháp thứ nhất là cách gii quyết triệt để, vì gen lành sẽ được đưa vào đúng vị trí của nó trên bộ gen và chịu tác động bình thường của các trình tự biểu hiện gen đó. Cho đến nay, chưa có thành tựu đáng kể nào trong lĩnh vực này vì người ta chưa biết cách sửa chữa gen một cách đặc hiệu. Tuy vậy, kỹ thuật tái tổ hợp tưng đồng cũng đem dến những hy vọng rất lớn và khả năng thành công là điều hoàn toàn có thể hy vọng trong tương lai.

- Biện pháp thứ hai dễ thực hiện hn nhưng khi đưa thêm một gen cần thiết vào bộ gen, người ta không làm chủ được vị trí gắm xen của đoạn mới đưa vào. Điều này dẫn đến một số kết quả không lường trước được:

, Gen mới đưa vào không nằm trong phức hợp điều hoà nên có thể được biểu hịên một cách tuỳ tiện, không đúng nơi (đúng với loại tế bào, mô đặc hiệu) và không đúng lúc (đúng với chu trình phát triển cá thể), hoặc thậm chí không được biểu hiện.

, Gen mới đưa vào gây những hiệu quả không mong muốn.

, Gen gắn vào một vị trí có kh năng hoạt hoá một gen tiền ung thư dẫn dến sự biểu hiện quá độ của gen này gây ra ung thư.
Hiện nay, mọi cố gắng đều nhằm giải quyết những vấn đề này. Đặc biệt, liệu pháp gen trong trường hợp này được giới hạn chặt chẽ trên tế bào sinh dưỡng. Việc tác động lên gen trong tế bào sinh dục bị nghiêm cấm vì lý do đạo đức, con người từ chối việc thay đổi gia sản di truyền có thể lưu lại cho con thế hệ sau.
Liệu pháp gen có thể được tiến hành thông qua một số cách sau:

, Chuyển trực tiếp gen vào mô người bệnh.

, Tạo vectơ virut để chuyển gen một cách hiệu quả tới tế bào (in vivo). Có thể sử dụng các vectơ của virus hoạt động. Virus nhiễm trực tiếp vào tế bào bằng cách gắn với chúng và truyền thông tin di truyền vào trong tế bào. Vì các virus tự nhiên tự sinh sản bên trong tế bào chủ nên gây hại với vật chủ mang chúng. Tuy nhiên, có thể loại trừ hay làm mất các phần này của virus, ngăn không cho chúng tái bản trong các tế bào chủ. Ngày nay các virus không có khả năng tái bản này được sử dụng chung cho các nghiên cứu liệu pháp gen trên người và động vật.

, Sử dụng các kỹ thuật đa dạng để chuyển các gen vào những
tế bào bên ngoài người bệnh, sau đó chuyển các tế bào đã được thiết kế này vào người bệnh (ex vivo). Các liệu pháp gen ex vivo đưa hay biến đổi các gen trong tế bào ngoài cơ thể. Sau đó cấy trở lại cơ thể các tế bào đã được biến đổi này Phương pháp này được sử dụng chung để phân phối các nhân tố phát triển và các phân tử khác tới các vùng đặc hiệu của c thể. Chúng cũng được sử dụng để sinh ra các dòng tế bào đã được biến đổi toàn diện cho sự cấy ghép. Giống như gen in vivo, các tế bào được chuyển có thể biểu hiện các protein lạ gây sưng tấy hay đáp ứng miễn dịch. Các phưng pháp chuyển gen ngày nay được sử dụng để tạo các sinh vật hay tế bào sn xuất và tiếp tục biểu hiện các gen đặc hiệu.

Các nhóm chuyên gia đã chia liệu pháp gen thành các mức khác nhau:
, Chuyển gen với sự hoà nhập (gen được kết hợp chặt chẽ với DNA của vật chủ)
, Chuyển gen không hoà nhập (gen không kết hợp chặt chẽ với DNA của vật chủ)
, Sử dụng các oligonucleotide tổng hợp nhân tạo gọi là các phân tử ribozyme/antisense không có các thành phần điều hoà (sự biểu hiện gen đã bị biến đổi).

2. Các bước cơ bản trong liệu pháp gen:



Được caspermini sửa chữa / chuyển vào 18:43 ngày 27/09/2003

Xin loi, ban, do ban post bai o ma TCVN-3 nen bai khong the doc duoc. Ban phai chuyen sang UNICODE thi moi on thoa.
Huong dan: ban co the vo trang web http://www.vnequation.de/vietuni.html
de thuc hien lenh chuyen doi
Cam on ban da post bai
I. Liệu pháp gen là gì?
A. Giới thiêụ chung:
Vào ngày 14-9-1990, nhóm nghiên cứu tại học viện sức khỏe quốc gia của Mỹ (U.S.National Instituse of Helth) đ? tiến hành chuỗi thử nghiệm liệu pháp gen đầu tiên cho bé Ashanti Desilva 4 tuổi. Sinh ra với căn bệnh di truyền hiểm nghèo có tên là sự thiếu hụt miễn dịch tổ hợp m?nh liệt (severe combined immune deficiency SCDI), cô bé thiếu hệ thống miễn dịch và có thể bị tổn thưng khi mắc phi bất kỳ mầm bệnh nào. Những đứa trẻ mắc bệnh này thường không chống lại được sự lây nhiễm và rất khó sống đến tuổi trưởng thành, tuổi th của chúng luôn mắc bệnh tật. Ashanti được lập một hành lang bo vệ xung quanh, không tiếp xúc với những người ngoài gia đình, trong môi trường vô trùng tại nhà và được điều trị thường xuyên với kháng sinh liều cao.
Trong thủ tục liệu pháp gen của Ashanti, bác sĩ đ? loại bỏ các tế bào máu trắng ra khỏi c thể cô ta, cho chúng phát triển trong phòng thí nghiệm, chèn gen thiếu vào các tế bào này và sau đó chuyển tế bào đ? được biến đổi di truyền trở lại máu của bệnh nhân. Những kiểm tra trong phòng thí nghiệm đ? cho thấy liệu pháp này đ? làm tăng hệ thống miễn dịch của Ashanti, cô ta không bị cm lạnh trở lại, có thể đến trường và đ? miễn dịch với chứng ho. Thủ tục này không phi là một phưng thuốc, những tế bào máu trắng được xử lý về mặt di truyền chỉ làm việc trong một vài tháng và quá trình này phi lặp lại.
Mặc dù sự gii thích đn gin này của liệu pháp gen nghe như có kết qu kh quan, nhưng nó mở đầu cho một cuộc tranh luận kéo dài; con đường để liệu pháp gen được chấp nhận là không vững chắc và đầy những cuộc tranh luận. Liệu pháp gen sinh học ở người là rất phức tạp, một số công nghệ cần được phát triển và những căn bệnh cần được hiểu biết cặn kẽ hn trước khi liệu pháp gen có thể được sử đụng một cách thích đáng.
Tuy nhiên, không thể phủ nhận rằng, ngày nay liệu pháp gen là một lĩnh vực khổng lồ với c hội sinh lời lớn cho các nhà đầu tư có hiểu biết. Bằng chứng là sự phát triển của các nghiên cứu về liệu pháp gen trong hn một thập kỷ qua. Lĩnh vực này có tiềm năng vô cùng to lớn, một số người đ? so sánh tiềm năng đầu tư trong công nghệ sinh học đặc biệt là liệu pháp gen với kinh nghiệm trong lĩnh vực công nghệ những năm 1980.
Các gen điều khiển toàn bộ cấu trúc và chức năng của các tế bào cũng như các mô khác nhau trong c thể người. Những bệnh phá vỡ các quá trình bình thường này của chúng, do đó, tất c các bệnh di truyền có thể được thao tác và sử dụng để điều trị và chuẩn đoán người bệnh. Đây là c sở của tất c các sn phẩm liêụ pháp gen.
B. Liệu pháp gen và các bước c bn trong liệu pháp gen
1. Định nghĩa:
Trong các ứng dụng của sinh học phân tử vào y học, liệu pháp gen đối với các rối loạn di truyền mở ra nhiều triển vọng nhất, đồng thời cũng là hướng ứng dụng khó thực hiện nhất. Các định nghĩa về liệu pháp gen được thay đổi theo thời gian, ngày nay không có định nghĩa chung nào được chấp nhận cho khái niệm này. Song định nghĩa sau đây được sử dụng rộng r?i nhất trên các diễn đàn Quốc tế.
Định nghĩa: liệu pháp gen là kỹ thuật đưa gen lành vào c thể thay thế cho gen bệnh hay đưa gen cần thiết nào đó thay vào vị trí gen bị sai hỏng để đạt được mục tiêu của liệu pháp.
- Biện pháp thứ nhất là cách gii quyết triệt để, vì gen lành sẽ được đưa vào đúng vị trí của nó trên bộ gen và chịu tác động bình thường của các trình tự biểu hiện gen đó. Cho đến nay, chưa có thành tựu đáng kể nào trong lĩnh vực này vì người ta chưa biết cách sửa chữa gen một cách đặc hiệu. Tuy vậy, kỹ thuật tái tổ hợp tưng đồng cũng đem dến những hy vọng rất lớn và kh năng thành công là điều hoàn toàn có thể hy vọng trong tưng lai.
- Biện pháp thứ hai dễ thực hiện hn nhưng khi đưa thêm một gen cần thiết vào bộ gen, người ta không làm chủ được vị trí gắm xen của đoạn mới đưa vào. Điều này dẫn đến một số kết qu không lường trước được:
, Gen mới đưa vào không nằm trong phức hợp điều hoà nên có thể được biểu hịên một cách tuỳ tiện, không đúng ni (đúng với loại tế bào, mô đặc hiệu) và không đúng lúc (đúng với chu trình phát triển cá thể), hoặc thậm chí không được biểu hiện.
, Gen mới đưa vào gây những hiệu qu không mong muốn.
, Gen gắn vào một vị trí có kh năng hoạt hoá một gen tiền ung thư dẫn dến sự biểu hiện quá độ của gen này gây ra ung thư.
Hiện nay, mọi cố gắng đều nhằm gii quyết những vấn đề này. Đặc biệt, liệu pháp gen trong trường hợp này được giới hạn chặt chẽ trên tế bào sinh dưỡng. Việc tác động lên gen trong tế bào sinh dục bị nghiêm cấm vì lý do đạo đức, con người từ chối việc thay đổi gia sn di truyền có thể lưu lại cho con thế hệ sau.
Liệu pháp gen có thể được tiến hành thông qua một số cách sau:
, Chuyển trực tiếp gen vào mô người bệnh.
, Tạo véct virut để chuyển gen một cách hiệu qu tới tế bào (in vivo). Có thể sử dụng các vect của virus hoạt động. Virus nhiễm trực tiếp vào tế bào bằng cách gắn với chúng và truyền thông tin di truyền vào trong tế bào. Vì các virus tự nhiên tự sinh sn bên trong tế bào chủ nên gây hại với vật chủ mang chúng. Tuy nhiên, có thể loại trừ hay làm mất các phần này của virus, ngăn không cho chúng tái bn trong các tế bào chủ. Ngày nay các virus không có kh năng tái bn này được sử dụng chung cho các nghiên cứu liệu pháp gen trên người và động vật.
, Sử dụng các kỹ thuật đa dạng để chuyển các gen vào những
tế bào bên ngoài người bệnh, sau đó chuyển các tế bào đ? được thiết kế này vào người bệnh (ex vivo). Các liệu pháp gen ex vivo đưa hay biến đổi các gen trong tế bào ngoài c thể. Sau đó cấy trở lại c thể các tế bào đ? được biến đổi này Phưng pháp này được sử dụng chung để phân phối các nhân tố phát triển và các phân tử khác tới các vùng đặc hiệu của c thể. Chúng cũng được sử dụng để sinh ra các dòng tế bào đ? được biến đổi toàn diện cho sự cấy ghép. Giống như gen in vivo, các tế bào được chuyển có thể biểu hiện các protein lạ gây sưng tấy hay đáp ứng miễn dịch. Các phưng pháp chuyển gen ngày nay được sử dụng để tạo các sinh vật hay tế bào sn xuất và tiếp tục biểu hiện các gen đặc hiệu.
Các nhóm chuyên gia đ? chia liệu pháp gen thành các mức khác nhau:
, Chuyển gen với sự hoà nhập (gen được kết hợp chặt chẽ với DNA của vật chủ)
, Chuyển gen không hoà nhập (gen không kết hợp chặt chẽ với DNA của vật chủ)
, Sử dụng các oligonucleotide tổng hợp nhân tạo gọi là các phân tử ribozyme/antisense không có các thành phần điều hoà (sự biểu hiện gen đ? bị biến đổi).
2. Các bước c bn trong liệu pháp gen:
Concay

May quá, em cũng đang đau đầu về cái vụ chuyển từ TCVN3 sang UNICODE đây, may mà anh cho em cái link đó, em đã sửa lại bài viết rồi, cảm ơn anh nhiều nhé.
Tiện thể, anh có thể cho em biết có chương trình nào thực hiện chức năng chuyển từ TCVN3 sang UNICODE không? Để có thể chuyển offline không có mỗi lần chuyển phải vào trang web đó cũng hơi bất tiện.
Casper

Bác vào word, bật Vietkey lên chọn bảng mã Unicode dựng sẵn (ở Vietkey 2000 là 39 - VnUnicode 1). Nếu bác dùng win98se trở lên thì máy bác đã có sẵn phông Unicode. Nếu không thì bác có thể down, hoặc ra quán mua cái đĩa Collection về mà cài.

LOVE

Ý tôi hỏi ở đây là khi tôi đã có sẵn một bài viết với TCVN3, font VnTime, thì có chương trình nào giúp chuyển sang mã UNICODE với font Arial chẳng hạn, chứ ngồi gõ lại từ đầu bằng UNICODE thì nói làm gì.
Thanks sự quan tâm của bác.
Casper

2. Các bước cơ bản trong liệu pháp gen:
Trong thực nghiệm, người ta dùng các vectơ virus để chuyển các gen vào tế bào động vật theo 2 bước:
Bước 1: người ta tạo thành các vectơ tái tổ hợp có mang gen cần chuyển. Trước đó, các virus đã được biến đổi để không còn khả năng sao chép, đồng thời lại có khả năng biểu hiện mạnh gen cần đưa vào cơ thể. Các biến đổi này bao gồm việc loại bỏ
các trình tự cần cho sự sao chép của virus và được gắn vào trước gen những trình tự promotor mạnh. Sau đó, vectơ tái tổ hợp được đưa vào tế bào nuôi cấy. Loại tế bào được sử dụng nhiều nhất là tế bào tuỷ xương vì dễ nuôi cấy lại bao gồm nhiều
tế bào nguồn đa thế (pluri potential)
Bước 2: các vectơ virus có mang gen lành được đưa vào cơ thể mà từ đó người ta đã tách các tế vào tuỷ xương để chuyển gen. Như vậy, có thể xem đây là kỹ thuật ghép tự thân dù gen ghép vào là gen lạ đối với cơ thể. Trở ngại lớn là protein do gen
lạ tạo ra có thể kích thích sản sinh kháng thể chống lại chính nó, hơn nữa, nếu việc chuyển gen vào tế bào nuôi cấy thường thành công thì việc đưa tế bào chuyển gen trở lại cơ thể lại ít khi có hiệu quả do nhiều nguyên nhân.
Gần đây nhất, một quy trình liệu pháp gen vừa được thông qua nhằm làm chậm sự phát triển của bệnh AIDS. Người ta chuyển các oligonucleotit đối (antisens) bổ sung cho một số trình tự của virus HIV (trình tự TAR, REV) vào các tế bào của một người lành là anh em sinh đôi của người bệnh. Sau đó các tế bào này được tiêm vào bệnh nhân. Các Oligonicliotit đối TAR sẽ ức chế sự sao chép của virus khi bắt cặp và vô hiệu hóa trình tự TAR đóng vai trò trong sự sao chép. Còn các Oligonucleotit đối REV, khi bắt cặp với trình tự REV sẽ ngăn sự vận chuyển mRNA từ nhân ra tế bào chất.
3. Ứng dụng của liệu pháp gen trong điều trị bệnh:
Ngày nay có 533 các thử nghiệm liệu pháp gen diễn ra trên thế giới. Với 407 thử nghiệm diễn ra ở Mỹ, Mỹ là thị trường dẫn đầu trong các thử nghệm của liệu pháp gen. Trong số 533 thử nghiệm diễn ra, có 322 thử nghiệm trong điều trị bệnh ung
thư, chiếm 62,28%, 37 thử nghiệm trong điều trị HIV chiếm 6,94%, ngoài ra là các thử nghiệm với các bệnh tim mạch, u xơ, SCID (severe combined immune deficiency), chứng máu khó đông
Các thử nghiệm liệu pháp gen hiện tại trên thế giới (tháng 3-2001)
Tổng số thử nghiệm 533
Ung thư 332
HIV 37
Bệnh tim mạch 36
u xơ 27
SCID (severe combined immune deficiency) 10
Máu khó đông 6
Rối loạn gen đơn 71
Các bệnh khác 14
C. Các yếu tố kỹ thuật trong chuyển gen
?oKhông hệ thống véct nào là tối ưu cho tất cả các kỹ thuật của liệu pháp gen?
Kay, M., Glorioso, J., Naldini, L. Nature Medicine 7 (1) 2001
1. Tổng quan:
Liệu pháp gen tiêu biểu cho sự mở rộng hợp lý của thuốc sinh học (Bio-medicine). Một ví dụ thường gặp là sử dụng ADN tái tổ hợp sản xuất các phân tử có hoạt tính sinh học (như insulin) để chữa trị và kiềm chế các bệnh. Sự thành công của sinh học phân tử và các dự án về bộ gen người đã tạo bước đột phá
trong việc tìm ra các gen liên quan đến bệnh, liệu pháp gen từ lý thuyết trở thành thực tiễn. Ngày nay, có trên 533 thử nghiệm y học tập trung vào liệu pháp gen với hơn 8.000 người bệnh tham gia. Một số hãng công nghệ sinh học nổi bật có các sản phẩm trong các thử nghiệm y học rất sớm, và một vài dự đoán phân tích rằng liệu pháp gen, như một lĩnh vực, có thể đem lại lợi nhuận trước năm 2005.
Tuy nhiên, các yếu tố tích cực này cũng ngang bằng với sự không hiểu biết sinh học của chuyển gen (nhân tố phức tạp và không được biết đến hoàn toàn) và ảnh hưởng của các sự kiện hiện tại trong ý kiến cộng đồng về y học phân tử.
2. Các cơ sở của sinh học phân tử:
Thông tin di truyền dưới dạng DNA tồn tại trong mỗi tế bào của cơ thể (trừ các tế bào máu). Mỗi tế bào chứa đựng các thông tin để xây dựng bất cứ dạng tế bào hay mô đặc hiệu nào của sinh vật. Vì các tế bào và mô khác nhau quy định sự sản xuất của các khối cấu trúc (building block) khác nhau nên DNA chứa đựng thông tin liên quan đến khối các cấu trúc để sản xuất các mô đặc hiệu. Sự tiến hoá đã cung cấp một giải pháp tuyệt vời cho vấn đề này. DNA được tạo nên từ một chuỗi của bốn phân tử khác nhau: adenine, guanine, cytosine và thymine. Sự kết hợp của các phân tử này tạo nên ?ongôn ngữ? của DNA. DNA có bốn thành phần khác nhau. Gen, được tạo nên từ DNA mã hoá tất cả các protein, là khối cấu trúc của tế bào. Các promoter cho phép sự hoạt hoá của các gen và qua đó các protein đặc hiệu được biểu hiện. Các vùng khác của DNA không mang mã và là phần quan trong để bảo tồn cấu trúc của nhiễm sắc thể. Thành phần này của của DNA vô cùng quan trọng trong các dự án về bộ gen, tính tuần hoàn đoạn của DNA trong các vùng không mang mã có thể được kết hợp với các gen đã biểu hiện, cho chúng ta phương pháp tìm kiếm các gen chưa biết.
Tự nhiên đã phát triển một cách thức rất thông minh mà qua đó các protein đặc hiệu chỉ được biểu hiện trong các mô dặc hiệu. DNA sắp thành các sợi dài gọi là nhiễm sắc thể. Có hai bản sao của mỗi gen tồn tại trong tế bào. Tuy nhiên có một số trường hợp ngoại lệ, các gen tồn tại trong các nhiễm sắc thể X và Y (nhân tố qu?Zyết định giới tính) có thể chỉ có duy nhất một bản sao. Thông tin được truyền từ DNA đến các cơ quan phức tạp hơn. Quá trình phiên mã được bắt đầu bởi các phân tử nhận biết đặc hiệu có tên là các nhân tố phiên mã (nhân tố gắn với các chuỗi điều hoà của gen và cho phép sự sao chép được tiến hành). Bản sao được tạo thành từ phân tử ban đầu gọi là RNA trong nhân tế bào. Bản sao sau đó ra khỏi nhân tế bào, chuyển đến lưới nội chất, nơi mà nó sẽ được dịch mã tổng hợp thành protein.
3. Các cơ sở của liệu pháp gen:
Để sự chuyển gen xảy ra, cần hội đủ một số điều kiện sau đây:
, Đầu tiên, phải có bản sao đầy đủ của gen thích hợp với những trình tự điều hoà thích hợp (trình tự khởi động), trình tự khởi động có thể là duy nhất đối với gen đặc hiệu, bằng cách này cho phép gen chỉ biều hiện trong các mô mà thông thường chúng được biểu hiện. Lần lượt, các gen có thể được kết nối với các trình tự khởi động, hoạt hoá trong tất cả các mô (phương pháp chung nhất được sử dụng ngày nay) hoặc có thể kết nối
với các trình tự có thể bật tắt như một công tắc. Những thao tác như vậy có thể đạt được qua công nghệ DNA tái tổ hợp.
, Thứ hai, phải lựa chọn kỹ thuật đích. DNA cần kỹ thuật này để có thể tiếp cận với tế bào. Ba kỹ thuật cơ bản được sử dụng để hoàn thành việc này:
+ DNA có thể được gắn trực tiếp với các tế bào hoặc cấy vào mô. Nó có tên là sự chuyển DNA trần (nacked DNA transfer)
+ DNA có thể được sử đụng dể tạo nên con thoi dịch chuyển dạng virus (viral transfer shuttle). Đây là phương pháp hầu như chắc chắn nhất của sự chuyển DNA. DNA xâm nhập không hiệu quả vào tế bào vì nó khó có thể xuyên qua lớp màng lipit kép, nhưng vectơor virus dễ dàng làm việc này.
+ DNA cũng có thể phối hợp với các chất hoá học phức tạp khác nhau để khuếch đại khả năng dịch chuyển qua màng tế bào của nó.
, Thứ ba, có hai phương pháp ứng dụng liệu pháp gen: liệu pháp gen có thể ứng dụng trực tiếp với bệnh nhân hoặc có thể ứng dụng trên các tế bào đã tách ra khỏi người bệnh (như tế bào tuỷ xương) sau đó cấy trở lại người bệnh. Trong tương
lai, các thao tác liệu pháp gen của tế bào gốc phát triển trên môi trường mô tế bào và sau đó cấy lên người bệnh sẽ là tiến triển tột cùng.
Mỗi kỹ thuật trên đều có những thuận lợi và khó khăn riêng. Khi chọn phương pháp phân phối gen, một số nhân tố cần được cân nhắc:
, Hiệu quả của liệu pháp phải được đặt lên hàng đầu.
, Sau đó, gen chuyển đổi phải được điều hoà đúng đắn. Nó phải được hoạt hoá đúng thời gian, với độ dài thời gian chính xác và đúng số lượng.
Những vấn đề này là rào cản to lớn cho sự phát triển và phổ biến của liệu pháp gen. Hiện nay đích ứng dụng quan trọng nhất của liệu pháp gen là các căn bệnh hiểm nghèo, ở đó mô bệnh dễ dàng bị ảnh hưởng và những bệnh mà sự điều hoà chính xác của gen được chuyển là không cần thiết. Đúng như mong muốn, hiệu quả của liệu pháp trong các trường hợp này dễ dàng quản lý. Sự tinh vi của chúng ta trong tiết kế vectơ và promotor ngày càng tăng, mở ra những ứng dụng rộng rãi của việc điều trị các bệnh hiểm nghèo (như bệnh đái đường) thông qua sự tập hợp thông tin của các dự án về bộ gen người mà ở đó sự điều hoà gen là phức tạp hơn.
Để chuyển gen, trong các nghiên cứu sử dụng các vectơ có hoặc không có bản chất virus nhằm đưa gen mục tiêu đến các tế bào. Hiện nay, các nghiên cứu phân phối gen nhờ retrovirus diễn ra nhiều nhất sau đó đến adenovirus.
4. Các vectơ chuyển gen có bản chất virut:
Casper

4. Các vectơ chuyển gen có bản chất virut:
4.1. Các bước quan trọng để hoạt hóa thành công virut và chức năng của nó:
Sự sử dụng virut cho liệu pháp gen có cơ sở là các chức năng cơ bản của nó:
, Sự dịch chuyển đặc hiệu của vật chất di truyền đến tế bào. Virut chứa vật chất di truyền được bao quanh bởi lớp màng protein. Đầu tiên, virus gắn tới các tế bào riêng biệt bằng sự tương tác với điểm thụ cảm (hay một chuỗi các điểm thụ cảm)
trên bề mặt tế bào. Tiếp đó, virus vào tế bào bởi sự tương tác với các phân tử đặc hiệu trên bề mặt tế bào, bằng cách này nó dễ dàng đi xuyên qua lớp rào chắn màng tế bào.
, Sự phụ thuộc vào dạng của vectơ virus được sử dụng, những gen được mang bởi virus hoặc được nhân bản sử dụng nguyên liệu của chính các tế bào hoặc được tiếp hợp tới nhân của tế bào, nơi mà các nhiễm sắc thể và DNA trung tâm tồn tại. Các
gen đặc hiệu được mang và được tiếp hợp bởi virus phiên mã thổng hợp RNA và dịch mã tạo thành protein để tạo nên chức năng mong muốn hay sản phẩm của liệu pháp.
, Các virus khác nhau có mức độ khác nhau trên phương diện chuyển gen của chúng tới các tế bào và tạo ra các sản phẩm gen. Hơn nữa, hiệu quả cuối cùng của chúng đối với các gen chức năng trong tề bào không giống nhau và có thể biến đổi từ tế bào này đến tế bào khác hoặc mô của cơ quan này đên mô cơ quan khác.
Những vấn đề này hưởng lớn tới thuận lợi y học và thành công của chiến lược liệu pháp gen có cơ sở là vectơ virus.
Tất cả các vectơ được sản xuất từ các virus tái tổ hợp kiểu hoang dại đã được xác định. Nói chung, các gen có vai trò trong tái bản virus được loại bỏ để ngăn cản sự truyền đi không mong muốn của vectơ virus và để ngăn cản các vectơ virus liên
quan đến bệnh.
Hiện tại, có 4 dạng chính của vectơ virus đang được sử dụng trong nghiên cứu và ứng dụng: adenovirus, adeno-associate virus (AAV), retrovirus và herpes đơn hình.
4.2 Vectơ Adenovirus:
Một trong những vectơ liệu pháp gen chung nhất hiện đang sử dụng là vectơ có cơ sở adenovirus. Nó gây bệnh khó thở ở người (cảm lạnh, nhiễm trùng dạ dày) và có 47 dạng khác nhau (gọi là kiểu huyết thanh) được tìm thấy ở người. Kiểu 2 và 5 được sử dụng chung nhất cho các ứng dụng liệu pháp gen.
Điểm đầu tiên trong sản xuất vectơ liệu pháp gen là di chuyển gen điều khiển sự tái bản (sự phát triển) của virus trong mô. Sự sinh sn và phát triển của một lượng nhỏ virus mới là nguyên nhân chung cho những hiệu ứng độc do nhiễm virus.
Bằng cách tách virus này, liệu pháp gen có thể di chuyển các gen của virus. Bộ gen của adenovirus đã được nghiên cứu tổng quát, chứa DNA xoắn kép gồm 50 gen, dài 36 kilobase (KB). Gen E1 điều hoà sự phiên mã trong khi gen E2 và E3
điều hoà quá trình dịch mã của bộ gen. Các vectơ có những gen đã tách này cho phép mang gen dài 8kb. Trước đây, sự phát triển của các vectơ này dựa trên việc sử dụng virus giúp đỡ (helper virus) để cung cấp các chức năng của gen bị huỷ.
Tuy nhiên, ngày nay một dòng tế bào có giá trị thưng mại đã được tạo ra để mang các gen bị xoá dạng vectơ. Sự phát triển của các dòng tế bào có thể làm adenovirus có giá trị thưng mại và an toàn hn. Khi đó rủi ro của việc sử dụng virus kiểu hoang dại được gim bớt. Trên hết, sản phẩm vectơ này có hiệu quả, với sự kết tụ 1x1013 đoạn virus/ml đang được sản xuất. Phép đo hoạt tính vectơ thực tế rất quan trọng trong liệu pháp gen.
Sự đo các phần tử vectơ đn độc không bao hàm rằng tất cả các đoạn là nhiễm và do đó, có hoạt tính. Hiện nay, có những cố gắng tiêu chuẩn hóa liều lượng và hoạt tính của các vectơ virus.
Thật không may, hệ thống vectơ adenovirus đã xuất hiện một vài khó khăn. Sự sản xuất của liệu pháp gen là giới hạn cho một chu kỳ thời gian ngắn và DNA đã được chuyển không trở thành một phần của DNA trên tế bào chủ. Các áp dung trở lại của vectơ adenovirus cũng có thể gây ra đáp ứng miễn dịch mạnh trên vật chủ, có nguy cơ dẫn tới các biến chứng nghiêm trọng. Các trọng tâm nghiên cứu hiện nay nhằm cải tiến vectơ adenovirus đích và gim các phn ứng miễn dịch do virus gây ra, mang tới thành công đầy hứa hẹn trong việc sự sử dụng các vectơ phá huỷ bên trong (gutted vectơ) chỉ sử dụng vỏ ngoài của adenovirus. Sự phát triển thú vị khác là khả năng điều khiển vectơ adenovirus đích tới các nhóm tế bào đặc hiệu. Công nghệ ?oretargeting? bao gồm việc sản xuất kháng thể cho protein thụ thể có vỏ adenovirus, nhân tố được sử dụng để gắn kết và gia nhập tế bào. Kháng thể này được hợp nhất với kháng thể đơn dòng (monoclonal) chống lại protein đặc hiệu tồn tại trên bề mặt của tế bào. Vectơ sau đó hoà trộn với kháng thể dung hợp. Khi được sử dụng, chỉ những tế bào biểu hiện protein đặc hiệu được chữa trị bằng vectơ này. Một số công ty (ví dụ: GenVec) sản xuất vectơ adenovirus với sự biến đổi bề mặt điểm thụ cảm, điểm sẽ kết hợp với các tế bào khác nhau.
Sự phân loại của các vectơ khác nhau này sẽ cho phép adenovirus đích tới những mô khác nhau qua việc sử dụng các kháng thể.
Hình 6: S đồ cấu trúc của vectơ adenovirut kết tụ cao (high-capacity adenoviral) HC-Ad. Tất cả các gen của virus HC-Ad bị xoá, chỉ còn đầu bên trái và phải của Ad5 và DNA thêm vào (stuffer DNA) thu được từ gen C346 và HPRT. AdSTK109 chứa bộ gen hAAT bao gồm liver và promoter macrophage đặc hiệu, trong AdGS85, hAAT cDNA được biểu hiện từ promoter cytomegalovirus của người ((hCMV promoter). AdSTK129 chỉ
chứa DNA thêm vào và không biểu hiện bất cứ gen chuyển nào.
4.3 Vectơ Adeno-associated Virus (AAV):
AAV là một parvovirus không xuất hiện trong các bệnh do vi sinh vật ở người. Virus này có thể chuyển DNA tới các tế bào không phân chia và hoà nhập với DNA của tế bào chủ. Điều này mở ra khả năng ứng dụng của một vectơ chống lại các bệnh kinh niên. Trong dài hạn, sự biểu hiện của liệu pháp gen đã được chứng minh. Virus này nhỏ do đó chỉ có thể mang những gen có kích thước giới hạn. Nó cũng khó sản xuất hn các vectơ khác nên tính thưng mại hiện nay bị hạn chế. Có 6 kiểu huyết thanh (serotype) của AAV, kiểu 2 thường được sử dụng trong các
ứng dụng của liệu pháp gen. Do kích thước nhỏ, vectơ này chỉ mang được gen có kích thước lớn nhất là 5 kB. Như vậy, không thể chuyển được các gen phức tạp với kích thước lớn. Một số phương thức được đề ra để giải quyết vấn đề này. Một trong số đó là kỹ thuật liên kết bộ gen vectơ để phân cắt một số gen hợp nhất (cooperating gene) và phân phối chúng tới đích, sử dụng hai vectơ phân cắt. Một cách trung gian là sự nhân bản của các vectơ dung hợp sử dụng lớp vỏ của adenovirus kết hộ với bộ gen của vectơ AAV. Điều không thuận lợi của phương pháp
là vectơ này đòi hỏi sự giứp đỡ của adenovirus để được tổng hợp. Điều này có thể dẫn đến sự hợp tác mạo hiểm với vectơ adenovirus (phn ứng miễn dịch?). Gần đây, 3 plasmid, hệ thống virus helper tự do (helper virus free system) đã phát triển
cho phép sản xuất các helper tự do của vectơ này. Thuận lợi chính của hệ thống vectơ AAV là nó hoà nhập với nhiễm sắc thể của tế bào chủ. Điều này cho phép các vectơ được chuyển biểu hiện một cách ổn định và lâu hơn.
Hình 7: cấu trúc bộ gen của kiểu hoang dại (wild-type) và của vectAAV.
, (A) Bản đồ bộ gen của AAV hoang dại chứa các c cấu đọc (reading frames) Rep và Cap, các promoter (p5, p19, và p40), polyadenylation site (pA), và inverted terminal repeats (ITR). Quá trình phiên mã của virus mã hoá các protein Rep và Cap (VP1-3) khác nhau được vẽ dưới bộ gen. Các protein Rep nhỏ hn được dịch m? từ các điểm khởi đầu nộ tại (internal initiation sites).
, (B) bản đồ của vect AAV, cho thấy sự thay thế các gen Rep và Cap của virus với băng chuyển gen (promoter, transgene cDNA và polyadenylation site).
Nhưng thật không may, nếu AAV kiểu hoang dại hoà nhập tại điểm đặc hiệu trong nhiễm sắc thể 19 thì các vectơ tái tổ hợp lại mất tính đặc hiệu này và hoà nhập tuỳ tiện. Cho dù vậy, một vài thành công trong nghiên cứu trên động vật và người đã cho thấy rằng, sụ biểu hiện ổn định có thể đạt được với vectơ này,


Hình 8: Quá trình phiên mã của vectơ AAV. Các bước khác nhau cần cho quá trình phiên mã của vectơ AAV bao gồm: đầu tiên AAV tương tác với các receptor đa dạng và các phân tử coreceptor trên bền mặt tế bào, sự tiếp thu virion, nhân vào
trong tế bào và giải phóng bộ gen mạch đn vủa vectơ, sự lai của bộ gen đưa vào bổ sung (complementary input genomes) và sự hoà nhập nhiễm sắc thể trước biểu hiện gen có thể xảy ra từ khuôn xoắn kép DNA. Cấu trúc bậc hai tiềm tàng của bộ gen
vectơ bổ sung (episomal) xuất hịên như các phân tử vectơ RNA đã được mã hoá.

Hình 9: Chiến lược sản xuất rAAV. Plasmid tái tổ hợp chứa gen cần thiết, được tách dòng trong thời gian ITRs của AAV được chuyển với plasmid giúp đỡ tái tổ hợp có chứa wtAAV và các gen adenovirut cần thiết cho sự giải phóng, tái bản, và đóng gói rAAV trong 293 tế bào. Khong 48 đến 60 giờ sau, các tế bào bị dung giải và phần chiết thô chứa rAAV và các protein của tế bào bị tách ra lệ thuộc vào sự tinh chế sau này (qua ly tâm gradient mật độ và sắc kí cột). Các mẩu nhỏ rAAV của sự tinh chế được xác định chính xác và các virus đã tinh chế sau đó được sử
dụng cho các nghiên cứu in vitro và in vivo.
4.4. Vectơ Retrovirus:
Retrovirus nằm trong số các vectơ virus được phát triển đầu tiên. Vectơ này đã được sử dụng trong gần 60% dự án liệu pháp gen y học. Virus này có chứa vật chất di truyền là RNA và có kích thước 7 đến 11 kB. Khi vào tế bào, RNA virus cần trở
thành DNA trước khi nó có chức năng trên tế bào chủ. Điều này được thực hiện bởi enzim phiên mã ngược, RT (reversse transcriptase). Retrovirus có chứa enzim phiên mã ngược (enzim xúc tác cho sự tạo thành bản sao DNA của vật liệu di truyền RNA thông qua sự phiên mã ngược) và enzim hoà nhập (integrase) cần cho sự hoà nhập của retrovirus virus vào tế bào chủ. Bộ gen của tất cả các virus này nhỏ và đã được nghiên cứu đầy đủ. Retrovirus dễ dàng biến đổi về mặt di truyền do đó được sử dụng rộng rãi như một vectơ của liệu pháp gen. Virus murina leukaemia đã được biến đổi di truyền (MuLV) được sử dụng phổ biến nhất. Các retrovirus cổ điển chỉ nhiễm vào các tế bào phân chia (dividing cell) và vật chất di truyền của chúng sau khi chuyển thành DNA, hoà nhập với vật chất di truyền của tế bào chủ như một ?oprovirus?. Điều này giúp nó thích ứng với bênh ung thư, bệnh mà ở đó các tế bào phân chia rất nhanh, cũng như các bệnh cần thời gian dài để gen được ổn định vững chắc. Sự không thuận lợi của vectơ này là nó hoà nhập tuỳ tiện với DNA của tế bào chủ. Do đó, các rủi ro khi vectơ xâm nhập sẽ phá vỡ chức năng sinh l?Zí bình thường của tế bào chủ. Các
retrovirus cơ bản cũng cần sự phân chia của tế bào chủ để làm việc. Hiện nay tồn tại những lo ngại lớn hơn, đó là khả năng các vectơ retrovirus sẽ nhiễm vào tế bào mầm của người bệnh và sản ********* trùng hoặc trứng. Do vậy, tiềm tàng sự ảnh
hưởng đến sinh sn sau này. Tới nay, điều này đã được quan sát trên các động vật mẫu.
Các vectơ retrovirus cơ sở có thể trở thành vectơ được lựa chọn để thay đổi các tế bào gốc (stem sell). Khi đó, liệu pháp gen sẽ được sử dụng để sản xuất các gen chữa bệnh. Tuy nhiên, khi ứng dụng dạng vectơ này để tách dòng, rủi ro do đột
biến sẽ tăng. Một trong các phát triển thú vị gần đây là sự biến đổi của các lentivirus, dạng thay thế (sub-type) của retrovirus, trong các ứng dụng của liệu pháp gen. Dạng virus này gồm có HIV và SIV. Các retrovirus này hoà nhập với DNA của tế bào chủ,
do đó cung cấp sự biểu hiện gen ổn định trong một thời gian dài. Tuy nhiên, chúng có thể vào các tế bào không phân chia, do đó mở rộng khả năng ứng dụng của vectơ này.

Hình 11: Bộ gen của retrovirus (oncogenic retrovirus) gây bệnh ung thư MLV (murine leukemia virus). DNA của axit nucleic của virus (hình thái của bộ gen virus trong các tế bào bị nhiễm) xuất hiện. Hai virus có cùng có các gen cấu trúc gag, pol, và env. Gav mã hoá lõi virus và pol mã hoá các enzim tái bản. Gav và pol được biểu hiện ngay lập tức từ promoter trong LTR (long terminal repeat). Gen env được biểu hiện từ từng chỗ nối mRNA (singly spliced mRNA), mã hoá màng glycoprotein. Thêm vào các gen của HIV, được biểu hiện từ mRNA đa chỗ nối xuất hiện. Dù các vai trò không được biết đầy đủ song chúng quan trọng trong sự điều hoà biểu hiện gen của virus và trong sự điều chỉnh lây nhiễm.

Hình 10: Chu trình tái bản của retrovirut. Sự nhiễm bắt đầu khi lớp màng glycoprotein của virus nhận ra các vị trí receptor đặc hiệu trên bề mặt tế bào, sau đó sự dung hợp của màng virus và màng tế bào diễn ra giải phóng lõi virus (virus core) vào tế bào chất. RNA của virus, được sao chép thành phân tử DAN mạch kép, và xâm nhập vào nhân. Thời gian chính xác và cơ chế của việc này chưa được xác định rõ ràng. Sự hoà nhập vào DNA của nhiễm sắc thể xảy ra, bộ gen virus (từ bây giờ gọi là provirus) được giữ ổn định. Sản xuất RNA của virus và sau đó là các protein và enzim của virus. RNA của virus cũng kết hợp với protein của virus để tạo thành các phần lõi (core) mới. Các virion con trưởng thành (Mature progeny virions) có khả năng nhiễm vào các tế bào mới khi chúng được giải phóng ra ngoài tế bào và đã được bao bởi vỏ của chúng (gồm có màng tế bào và vỏ glycoprotein).

Hình 12: Các yếu tố đóng vai trò trong vectơ retrovirut đặc trưng. Các chuỗi cần thiết cho sự lan truyền retroviral đượcơ thể hiện. Tất cả các chuỗi protein của virus bị xoá và thay bằng gen ngoại lai (gen cần cho các mục đích nhất định). Gen ngoại lai có thể được biểu hiện từ promoter trong LTR của retrovirut (như
được thấy trong hình trên), hoặc từ bên trong, promoter của virus khác loại, như trường hợp xảy ra với vectơ lentivirut. Vai trò của các vùng khác nhau được đánh dấu.

Hình 13: sản xuất vectơ retrovirut. Các gen của virus biểu hiện từ các promoter không có bản chất retrovirut (nonretroviral) và đưa tới các tế bào, ni chúng bo tồn được sự ổn định và sản xuất các protein enzim cũng như cấu trúc virus. Khi vectơ retrovirut được đưa tới tế bào, vectơ virus RNA càn được bao gói, kết qu
trong sự sản xuất của các phần tử virus chứa bộ gen vectơ. Virus này có thể được thu lại và sử dụng để tiêm vào các tế bào đích nhằm đưa gen ngoại lai trong vectơ tới các tế bào. Vì các tế bào đích này không biểu hiện các protein của virus, vectơ sẽ không truyền bá xa hn. Các gen của virus trong các tế bào bao gói không mang cấu trúc đi xa hn vì chúng mất chuỗi cis-acting cần thiết cho sự nhân bản.
4.5 Các vectơ có cơ sở là herpes đơn hình (herpes simplex):
Casper

4.5 Các vectơ có cơ sở là herpes đơn hình (herpes simplex):
Vectơ herpes simplex là các vectơ có bản chất virus DNA. Chúng không hoà nhập vào DNA chủ nhưng giữ nguyên sự ổn định như một thể bổ sung (lantency), có khả năng cho phép các gen được chuyển ổn định trong một thời gian dài. Ngày nay, chúng được sử dụng trong các ứng dụng đặc biệt của liệu pháp gen với các khối u thần kinh. Herpes simplex virus (HSV) có hiệu quả cao đối với các nron thần kinh. Vectơ này đủ lớn để chuyển DNA lớn (tới 30 kB) nhưng khó thực hiện hn adenovirus
Khả năng to lớn này cho phép phân phối 5 gen khác nhau được điều khiển bằng các promoter khác nhau. Do đó, nếu quá trình trị bệnh cần đa gen, đây có thể là vectơ được chọn.
Hiện có rất ít kinh nghiệm trị bệnh với các vectơ này, nhưng kh nằng sử dụng của vectơ này cho việc phân phối gen trong một thời gian dài tới hệ thống thần kinh trung ưng ngày càng tăng.
4.6 Các vectơ virus khác:
Các vectơ virus khác đang trên đà phát triển bao gồm virus pox, virus Epstein-Barr, veovirus? Mỗi tiến triển mới có thể là lí?Z tưởng cho các thử nghiệm y học trọng tâm. Các chiến lược hiện nay là kết hợp DNA virus từ các vectơ đa dạng với sự phân phối liposome không có bản chất virus. Chiến lược này cho thấy một vài hứa hẹn trên các nghiên cứu với động vật.
5. Các vectơ không có bản chất virus:
5.1 Giới thiệu:
Trong khi sự phát triển và sử dụng các vectơ virus đã đem lại nhiều hứa hẹn, những giới hạn của nó đã thúc đẩy các nghiên cứu tìm kiếm các vectơ không có bản chất virus trong việc chuẩn đoán và điều trị bệnh. Có hàng ngàn công ty, phòng
nghiên cứu, trường đại học và các tổ chức chính phủ trên thế giới cố gắng phát triển các vectơ không có bản chất virus cho việc chuyển gen. Thật không cần thiết và cũng không thể đề cập đến tất cả các vấn đề trên ở đây, tôi chỉ nêu ra một số điểm có giá trị nghiên cứu lớn.
Như các tác dụng của vectơ virus, vectơ không có bản chất virus được sử dụng để gắn các vật chất di truyền, protein hay thuốc chính xác tới các tế bào ở người. Sự sử dụng của các vectơ không có bản chất virus trên người bệnh đã thu được nhiều thuận lợi rõ ràng so với các đối chứng của chúng. Đáp ứng miễn dịch tăng lên chắc chắn xảy ra ở các vectơ virus được bỏ qua nhờ sử dụng các vectơ không có bản chất virus. Như với bất cứ virus nào vào cơ thể, các vectơ virus được xác định bởi
hệ thống miễn dịch (như một yếu tố thù địch) và đáp ứng miễn dịch tăng cường để chống lại chúng. Các vectơ không có bản chất virus loại bỏ vấn đề này một cách êm thấm, về lý thuyết mà nói, làm cho chúng mất tính độc hại, mất đáp ứng miễn dịch
và đem lại hiệu quả cao hn. Chúng hướng tới sự đơn giản hơn trong việc thiết kế các vectơ virus do đó dễ ứng dụng hn cho sản xuất quy mô lớn và marketing.
Nghiên cứu và tiến triển trong phát triển các vectơ không có bản chất virus chậm hơn so với các vectơ virus. Do đó, hiệu quả của việc chuyển chúng hay thành công trong phân phối chúng tới các tế bào ít được nhận thấy hn các vectơ virus. Các vectơ virus cũng có thuận lợi trong khả năng gắn vật chất di truyền của chúng tới các tế bào chủ, cung cấp hiệu quả liệu pháp lâu dài hn. Trên thực tiễn, điều này có nghĩa là các vectơ virus đòi hỏi sự gắn vào ít hn để hoàn tất yêu cầu hiệu quả hơn các vectơ không có bản chất virus. Chỉ loại trừ đối với các nhiễm sắc thể nhân tạo ở người (HACs). Trong khi sự lặp lại điều trị là không lý tưởng cho người bệnh, các vectơ này có thể tự tồn tại trong các bệnh có cùng cách thức điều trị.
5.2 Phần tử trung gian chuyển gen:
Phần tử trung gian chuyển gen hay gene gun là kỹ thuật mang lại thuận lợi của việc dễ dàng tiếp cận của da. Nó sử dụng lực cơ học để đẩy tới DNA hay protein trong một số trường hợp sự tạo miễn dịch, trực tiếp với da của người bệnh. DNA được gắn vào bề mặt của các qu cầu vàng (đường kính ? 1 m). Vàng không gây ra đáp ứng miễn dịch và là một vectơ tuyệt ho để sử dụng cho kỹ thuật này. Phức hệ chứa đựng vàng và DNA sau đó được đẩy tới da. Bio-Rad, Inc (Hercules, CA) hiện hành sản xuất phần tử trung gian chuyển gen Helios và sử dụng heli để làm yếu tố thúc đẩy.
Không cần sử dụng virus hay các chất hoá học độc hại trong việc cấy phức hợp. Không giống một số vectơ sinh học, nó không phụ thuộc vào sự tham gia của các cơ quan thụ cảm bề mặt tế bào. Nó dường như cũng đáng tin cậy, có ý nghĩa trong việc đưa các đoạn vật chất di truyền lớn. Tuy nhiên, hiệu quả của nó bị giới hạn bởi mức độ xuyên qua mô để tới các mô đích khác nhau và sự biểu hiện trong thời gian ngắn của sản phẩm gen mong muốn. Liệu pháp này đã thành công trong ứng dụng điều trị ung thư da và các căn bệnh về da với các khuyết điểm di truyền đã biết. Tuy nhiên, ứng dụng hứa hẹn nhất của nó là tạo miễn dịch chống lại các khối u ác tính. Các văcxin DNA tiến hành theo hướng kỹ thuật ?ogene gun? đã được thử nghiệm trên 15 loài động vật (2 loài động vật có vú phát triển cao nhất) và đã cho thấy hiệu quả chống lại các bệnh cúm, HIV, sốt rét, lao?
Các nghiên cứu trung gian cũng đã có thành công ban đầu trong việc sử dụng kỹ thuật ?ogene gun? để gắn DNA vào các tế bào c tạo kết qu trong sản xuất dystrophảin (protein thiếu hụt trong các tế bào c bị bệnh của người bệnh). Kỹ thuật ?ogene
gun? là một ví dụ của vectơ ?ocơ học? đã đem lại nhiều hứa hẹn trong phòng và trị bệnh.
5.3 Nhiễm sắc thể nhân tạo:
Các nhiễm sắc thể nhân tạo của người (HACs) hiện vẫn chưa phát triển. Trong khi ứng dụng y học của HACs chỉ bắt đầu trong một vài năm, khái niệm này là một trong những lĩnh vực thú vị nhất của chuyển gen không có bản chất virus. Trong cơ thể, DNA từ một tế bào di truyền tới tế bào khác và cuối cùng từ cha mẹ sang con, sử dụng các NST.
Các NST là vật mang đóng vai trò tổ chức DNA đến các trình tự đặc hiệu, việc chuyển này dễ dàng. Thành công trong điều trị bệnh phụ thuộc vào khả năng thiết kế các phân tử vật mang hay các vectơ của chúng ta. Do đó có thể thiết kế NST nhân tạo ở người (HAC), hoặc NST nhỏ (minichromosome), chứa các đoạn DNA đặc biệt sẽ vào tế bào, tạo ra kết qu mong muốn không chỉ trong tế bào mà còn trong các tế bào sinh ra từ tế bào này. HACs là các vectơ không có bản chất virus có khả năng mang lại hiệu quả nhất. Chúng có thể được mang năng lượng để dễ dàng chuyển các đoạn tiền DNA lớn không quan trọng tới gắn vào các tế bào có kích thước xác định. Chúng có thể được gắn tới các tế bào và cố định ở đây mà không cần kết hợp với các NST gốc, do đó tránh được các đột biến di truyền, hoặc các biến đổi vật chất di truyền không cần thiết hay có hại với các tế bào. Các NST ban đầu dễ dàng chuyển gen tới các tế bào con qua phân tế bào, HACs cũng có thể bố trí việc chuyển của gen để gắn tới các tế bào con thông qua phân bào, điều này tạo nên sự duy trì liên tục biểu hiện gen trong toàn bộ cuộc sống người bệnh. Vì HACs được tạo nên bởi các thành phần xa lạ với cơ thể, chúng không thể hiện hiệu ứng với hệ thống miễn dịch.
HACs vẫn trong quá trình phát triển và có thể sẽ không có giá trị thưng mại trong một vài năm. Sự sản xuất HACs chỉ trong phòng thí nghiệm, giới hạn trong ứng dụng y học trên quy mô lớn. Khi máy tính mạnh hn và nhỏ hơn hiện nay, sự sản
xuất HACs sẽ chắc chắn trở nên không chỉ trong phòng thí nghiệm và khả năng sản xuất và ci tiến công nghệ sẽ tới trong vài năm nữa. Các công ty hiện nay đang nghiên cứu HACs bào gồm clontech, geron corp. chromos molecular systems, inc,
biogenix, gentronics và Chiron.
5.4 Liposomes
Casper

Bạn vào trang web http://www.vnequation.de/vietuni.html rồi download 1 phiên bản nào dó của vietuni như 6.1 hoặc 7.1 gì đó rồi mở nó ra. Đó là một trang web ứng dụng soạn thảo và chuyển đổi các font chữ với nhau. Bạn có thể sử dụng ofline như mọi phần mềm khác mà lại nhẹ hơn nhiều. Thân.
Box Công nghệ sinh học

5.4 Liposomes
Liposome là vectơ không có bản chất virus, lợi dụng các tính chất tự nhiên của màng tế bào để xâm nhập vào tế bào. Tất cả các vật chất sinh học có cực và chất béo đa dạng cũng như tính hòa tan nước. Thành phần và cấu trúc của nó xác định
các tính chất này. DNA tích điện âm, vật liệu hoà tan béo ưu thế. Tính béo cao và tích điện âm của màng tế bào người và màng nhân ngăn cản sự di chuyển DNA tự do ra vào tế bào. Liposome mang điện tích dưng, lớp vỏ hoà tan chất béo. Sự tích điện đối nhau của DNA và liposome làm chúng gắn chặt với nhau, tạo nên phức hợp hoà tan béo liposome-DNA. Tính hoà tan chất béo này cho phép vận chuyển nó qua màng tế bào
và màng nhân, dễ dàng đưa DNA vào nhân của tế bào.
Liposome là các phân tử không độc, dễ dàng sản xuất với số lượng lớn, khiến chúng trở thành vectơ rất hiệu quả trong các ứng dụng thương mại. Sự xâm nhập của protein trong vectơ ngăn cản đáp ứng miễn dịch của vật chủ và chúng không bị nguy hiểm hay bị tiêu diệt bởi các enzim (endonucleases) nội bào, hoặc các enzim có thể nhận ra và tiêu diệt các nhân tố lạ hay các nhân tố gây nguy hiểm DNA.
Chúng có các bất lợi y học. Mặc dù phức hệ di chuyển một cách hiệu quả qua màng tế bào nhưng nó không thành công trong việc xuyên qua màng nhân, tính ứng dụng của nó cũng bị giới hạn với các tế bào có tốc độ phân chia cao.
Một trong các ứng dụng thành công nhất của chuyển gen liposome là điều trị bệnh sơ cứng động mạch. Vào năm 1993, 10 thử nghiệm y học quan trọng đã nghiên cứu ứng dụng của liệu pháp gen với bệnh u x (cystic fibrosis). Năm trong số đó sử dụng các vectơ adenovirus và 5 sử dụng các vectơ liposome. Hiện nay có trên 4 thử nghiệm y học quy mô lớn theo cách này. Cả vectơ adenovirus và vectơ liposome biểu hiện hoà trộn thành công trong các nghiên cứu này. Các vectơ liposome, đầu tiên với liều lượng thấp hơn phụ thuộc vào các hiệu ứng phụ. Nghiên cứu cũng trên hướng sử dụng liposome trong điều trị các bệnh xơ cứng động mạch, ung thư tiền liệt tuyến, u ác tính và bệnh bạch cầu.
Hiện nay các nghiên cứu mới có mục tiêu sản xuất các hệ thống phân phối đích không có bản chất virus. Chúng gồm các liposome với các peptid, cho phép gắn liposome tới các tế bào đích.
So với tất cả các vectơ không có bản chất virus, chuyển gen liposome có tiềm năng ứng dụng lớn nhất tại thời điểm hiện tại.
Hình 14: plasmid DNA được bao trong pegylated immunoliposome (PIL) 85 nm. Bề mặt của liposome được kết hợp với vài nghìn sợi polyethyleneglycol (PEG) dài 2000
Dalton, và đỉnh của 1 đến 2% của các sợi PEG được buộc với ligand đích, như kháng thể đơn dòng đặc hiệu (specific mono clonal antibody) insulin receptor (IR) (MAb). Mab kết hợp với PIL trải qua transcytosis receptor trung gian đi qua hàng rào máu não và endocytosis receptor trung gian Đi qua màng plasma của tế bào não vào trong nhân.
5.5 Các polymer cation:
Các polymer cation là chuỗi các phức hợp tích điện dương. Khi trộn với DNA, chúng thành dạng phức hợp có tính chất của DNA kết tụ thành dạng dễ dàng vào nhân. Lĩnh vực nghiên cứu này là cuộc cách mạng nhanh chóng trong các phân tử không độc có tính hiệu quả hơn và chuyển các gen tới các tế bào đúng đích hơn.
Hình 15. Sự xâm nhập vào tế bào của các polymer cation
5.6 Cấy trực tiếp:
Sự cấy các DNA trần hay DNA tự do là một ví dụ khác của chuyển gen không có bản chất virus. Trong kỹ thuật này, DNA trần được cấy trực tiếp tới khối u hoặc mô. Phương pháp điều trị này có thể trực tiếp làm gảim sự sản xuất của các protein quan
trọng cho liệu pháp trị bệnh, có thể làm dừng sự sản xuất protein đặc biệt (ví dụ protein khối u cái điều khiển chuỗi vật lý trong tế bào) hoặc có thể gây ra đáp ứng miễn dịch giúp ngăn ngừa bệnh. Kỹ thuật này đã được ứng dụng cho cơ xương
trong điều trị các bệnh thoái hoá c (như bệnh loạn dưỡng cơ), ngăn cản các bệnh gan do virus (như bệnh viêm gan), và các bệnh tim (như bệnh lỗi sung huyết tim).
Ngoài ra, các nghiên cứu trên động vật đã thành công trong điều trị ung thư như u ác tính và u bướu. Trong khi giá thấp và tính dễ thiết kế làm nó được thu hút hơn, cũng có một số nhược điểm. Đầu tiên, sự quản lý hệ thống của vật chất di truyền là vấn đề và nguyên nhân gây phân huỷ bởi enzim nội bào và nhanh chóng bị dẹp bỏ (clearance) bởi gan và thận. Hiệu quả của biểu hiện di truyền cực kỳ khó nhận thấy. Hơn nữa, không có sự duy trì biểu hiện của gen và trong một số trường hợp, các DNA lạ (foreign DNA) có thể gây đáp ứng miễn dịch mạnh mẽ.
5.7 Liệu pháp tế bào gốc:
Chuyển tế bào gốc là kỹ thuật tạo ra sự đột biến lớn trong khoa học, chính trị và tôn giáo. Vì vậy, việc nghiên cứu chúng là hết sức hạn chế và chỉ diễn ra trên quy mô phòng thí nghiệm.
Các tế bào gốc là các tế bào đầu tiên trong cơ thể người. Chúng là các tế bào hoàn toàn giống nhau và hầu như có thể phát triển thành bất cứ tế bào nào ở người.
Các tế bào này có thể tách khỏi cơ thể, tinh chế trong phòng thí nghiệm, làm thành các dạng tế bào đặc hiệu khác nhau và sau đó các tế bào này được đưa trở lại vật chủ.
5.8 Biến đổi sự biểu hiện gen:
Sự biểu hiện gen ở người có thể bị biến đổi trực tiếp bằng cách sử dụng các công cụ phân tử có khả năng xuyên qua tế bào, gắn tới gen đích của chúng và điều hoà gen sản xuất protein. Có một số công cụ được dẫn ra dưới đây:
a) Oligomucleotide:
Oligonucleotide là các đoạn DNA ngắn có thể được sử dụng để kìm hãm quá trình dịch mã của gen. Mạch đối (antisense) của đoạn gen đã biết được tạo thành. Khi tới tế bào, các đoạn DNA này cuộn xoắn với RNA đặc hiệu và ngăn cản sự sản xuất protein từ RNA này. Công nghệ mạch đối rất hữu dụng trong nghiên cứu nhưng các ứng dụng thưng mại của nó rất không thành công. Điều này là do thời gian sống ngắn của các oligomucleotide và sự phân phối đặc hiệu khác nhau.
Hiện tại, có một dược phẩm oligomucleotide đã được chấp nhận là FDA, dùng để điều trị sự nhiễm cytomegalovirus ở võng mạc. Sự hoàn thành của dự án bộ gen người đã làm sống lại sự quan tâm trong lĩnh vực này với các kỹ thuật phân phối
mới làm liệu pháp oligomucleotide có hiệu quả hơn.
b) Ribozyme:
Ribozyme là các chuỗi RNA ngắn (30-50 nucleotide) của DNA hoặc RNA được thiết kế đặc biệt, có hoạt tính xúc tác (chúng gây ra các phản ứng hoá học). Ribozyme gắn với các đoạn RNA đặc hiệu và làm đoạn này bị tách khỏi RNA, do đó ngăn cản sự sản xuất protein. Các ribozyme này dường như có hiệu quả trong 12 đến 24 tiếng.
Đây là lĩnh vực nghiên cứu mới nhất với ứng dụng trong các bệnh ung thư và các bệnh thoái hoá thần kinh (neuro-degenerative). Thông tin từ dự án bộ gen người có thể đem lại các ứng dụng có giá trị cho công nghệ này một cách nhanh chóng.
c) Promoter:
Promoter và enhancer là các đoạn DNA điều khiển biểu hiện gen không bị phiên mã. Tất cả các vectơ liệu pháp gen hiện nay sử dụng các promoter của virus để điều khiển sự biểu hiện của các gen được chuyển. Sự thiết kế và sử dụng đặc hiệu mô dẫn tới các promoter là lĩnh vực nghiên cứu quan trọng, sau đó sẽ cho phép sự hoạt hoá của gen được chuyển chỉ trong các dạng mô dự kiến. Ví dụ, một vectơ sử dụng promoter cho kháng nguyên đặc hiệu tiền liệt tuyến được sử dụng trong các thử nghiệm y học chống ung thư tiền liệt tuyến. Vectơ này sẽ là đích của một số lớn các tế bào, nhưng gen được chuyển chỉ được hoạt hoá trong các tế bào bình thường sản xuất kháng nguyên đặc hiệu tiền liệt tuyến.
D. Kết luận
Từ các trình bày trên có thể thấy rằng, hiện nay có rất nhiều cách và phương thức để chuyển gen đích tới các tế bào nhằm thu được hiệu quả của liệu pháp. Tuy nhiên chúng ta cần nghiên cứu kỹ lưỡng các hiệu ứng phụ cũng như các tác động của nó
tới thông tin di truyền cuả người và các khía cạnh đạo đức, xã hội khác. Song cũng cần phải nhắc lại rằng ?oKhông hệ thống véctơ nào là tối ưu cho tất cả các kỹ thuật của liệu pháp gen?, do đó cần lựa chọn một cách chính xác nhất dựa trên hiệu quả của vectơ đối với nhóm bệnh mà mình nghiên cứu.
II. AIDS ?" nạn dịch toàn cầu
Casper