Những câu hỏi ngắn về PCR (vì topic kia bị lock rồi !)

Những câu hỏi ngắn về PCR (vì topic kia bị lock rồi !)

Em muốn hỏi là khi Taq tổng hợp một đoạn trọn vẹn trên template rồi, nó liền gắn thêm một nu "vô duyên không liên quan" (A) vào đầu cuối. Nếu ta sử dụng Taq không có hoạt tính proofreading thì coi như những đoạn được tổng hợp dở dang sẽ không còn cơ hội hoàn thiện nốt phải không ạ ?

Đúng vậy, đây cũng là nguyên tắc dùng để đọc trình tự 1 đọan DNA.

Phương pháp giải trình tự như anh nói là pp gì vậy, em chưa rõ lắm ! Mong được chỉ bảo. !

Tôi đoán là bác concay muốn nói đến phương pháp Sanger. Nguyên tắc của phương pháp này là lợi dụng sự đồng dạng của 2'''',3''''-dideoxynucleotide triphospates (ddNTPs) so với dNTPs, Taq không phân biệt được sự khác nhau của chúng nên lấy cả hai dạng làm nguyên liệu tổng hợp mạch mới. Tuy nhiên do thằng ddNTPs chỉ có H ở vị trí 3'''' thay vì OH như dNTPs nên một khi thằng Taq đã xài đến ddNTPs thì vô phương gắn thêm được vì không có nhóm -OH để tạo liên kết phosphodiester. Do đó các ddNTPs được gọi là terminator.
Theo phương pháp Sanger nguyên thủy thì để giải một trình tự DNA cần thực hiện 4 phản ứng PCR. Trong mỗi phản ứng gồm có một mạch (mạch đơn) DNA cần giải trình tự, primer được đánh dấu phòng xạ, hỗn hợp của một lọại ddNTP (ví dụ ddATP) và loại dNTP bình thường tương ứng (dATP) cùng ba loại dNTP còn lại (dTTP, dGTP và dCTP). Khi thực hiện phản ứng, sự tổng hợp DNA sẽ kết thúc mỗi khi có một ddATP được gắn vào mạch. Kết quả là ta có một loạt các mạch DNA được đánh dấu phóng xạ (nhờ primer) có độ dài khác nhau và độ dài này tương ứng với vị trí của base được dùng kèm với ddNTP (Adenosine trong ví dụ này) trong trình tự. Chạy điện di kết quả trên gel polyacrylamide có khả năng phân tách các đoạn sai khác nhau 1 nucleotide, ta có các vạch tương ứng với vị trí của base trong trình tự. Kết hợp kết quả diện di của 4 phản ứng dùng 4 loại ddNTPs khác nhau, ta có thể suy ra trình tự của đoạn DNA ban đầu.
Ghi chú: Hai hình trên được lấy từ trang http://www.bio.davidson.edu/courses/Bio111/seq.html
Tuy nhiên, hiện nay đa số các máy giải trình tự dùng phương pháp Sanger "cải biên", thường được gọi là "cycle sequencing".
Nguyên tắc cũng giống như phương pháp Sanger, chỉ khác là chất được đánh dấu lúc này không phải là primer mà là 4 loại ddNTPs. Bốn loại này được đánh dấu với 4 chất phát huỳnh quang khác nhau. Khi đó, với một máy đọc có khả năng phân biệt tín hiệu của 4 chất phát huỳnh quang này, ta chỉ cần thực hiện 1 phản ứng Sanger với cả 4 loại ddNTPs.
Bạn có thể coi minh hoạ dưới đây để hiểu hơn về phương pháp cycle sequencing:

http://www.dnalc.org/Shockwave/cycseq.html
Được weirdhobbit sửa chữa / chuyển vào 23:52 ngày 29/04/2004

Năm 1975 đánh dấu sự kiện một bộ gene hoàn chỉnh được giải trình đầu tiên, đó là một bacteriphage ~X174 khoảng 5kb. Tiếp theo sau đó, hàng loạt bộ gene được giải mã, như virus SV40 (5kb, 1977), DNA ti lạp thể của người (16 kb, 1981), bacteriophage lamda λ (49 kb, 1982) và virus Epstein Barr chứa đến 170kb (1984). Tuy nhiên, mãi đến 1995, thì công việc giãi mã genome mới thực sự đạt được một cột mốc quan trọng khi bộ gene của một sinh vật sống độc lập Haemphilus influenzae được giải mã hoàn chỉnh với độ dài lớn gấp 10 lần bộ gene của virus Epstein Barr (tức khoảng 1800 kb). Sáu năm sau, tức tháng 2 năm 2001, hai nhóm độc lập, một được tài trợ từ kinh phí chính phủ (Human Genome Project) và một công ty tư nhân Celera, đã đồng thời công bố bộ gene người hoàn chỉnh, theo tính toá sơ bộ thì không dưới 3 tỷ cặp base. Lần lượt, trước và sau cột mốc đó, các bộ gene của các sinh vật đóng vai trò quan trọng trong nghiên cứu sinh học hiện đại đã được giãi trình như E. coli, giun tròn Caenorhab***is elegans (thường gọi vắn tắt là C. elegans), ruồi giấm Drosophila và Arabidopsis (được mệnh danh là ruồi giấm của thực vật). Các dự án giải trình genome này đã kích thích và thu hút nhiều sư quan tâm của công chúng, vì các dự án này thể hiện cái gọi là ?ocạnh tranh trong sự hợp tác toàn diện?o, một kết quả tất yếu của sự toàn cầu hóa trong nghiên cứu khoa học. Hơn thế nữa, khi thực hiện các nhà khoa học đã cho thấy một cuộc cách mạng, một cuộc tiến hoámạnh mẽ về kiến thức, phương pháp luận của lĩnh vực genome, đặc biệt là các kỹ thuật giải mã với tần xuất cao.
Giải trình tự là bước cơ bản đầu tiên để xác định tính chất sinh hóa học của một đại phân tử sinh học. Do vậy khái niệm giải trình tự cũng đúng khi ta đọc trình tự acid amine của protein và acid nhân. Việc xác định trình tự protein là một công cụ rất quan trọng trước khi gene tương ứng của nó được xác định (nhân dòng và giải mã). Quan hệ giữa trình tự gene và trình tự protein là hai chiều, nghĩa là từ trình của cái này người ta suy luận ra cái kia và ngược lại. Do vậy cả hai hướng giải trình DNA và protein vẫn như là một đôi ngựa sóng đôi trên con đường chinh phục khoa học.
Cơ sở của việc đọc trình tự DNA
Bất chấp đoạn DNA cần xác định là một plasmid tái tổ hợp, một gene tự nhiên hay toàn bộ genenome của sinh vật thì việc đọc trình tự cũng chỉ là xác định thành phần các base và thứ tự các base này tạo nên đoạn DNA. Đó cũng là cách hiểu hiểu đơn giản và đầy đủ nhất.
Với sự ra đời của các máy đọc trình tự tự động, việc giải mã đã có những bước đột phá với tốc độ nhanh hơn, chính xác hơn: hơn thế nữa cùng với sự trợ giúp của máy tính việc giải mã một đoạn gene đơn lẻ hay toàn bộ genome không còn là một trở ngại về mặt kỹ thuật hay thời gian. Nhưng cho dù có nhiều biến thể của việc đọc trình tự ở nhiều protocol khác nhau, hay máy đọc trình tự tự động khác nhau, nhưng về cơ bản thì cơ sở (phương pháp luận) của việc đọc và giải trình tự là như nhau.
Vào giữa thập kỹ 1970, hai quy trình giải trình DNA khác nhau đã được đưa ra gần như cùng môt lúc:
1. Phương pháp của Sanger (1977) cho rằng trình tự của một sợi DNA đơn có thể được xác định bằng cách tổng hợp (nhờ xúc tác của enzyme) sợi bổ sung tương ứng, nhưng sản phẩm tổng hợp sẽ bị chấm dứt tại một điểm đặc biệt nào đó.
2. Phương pháp của Maxam và Gilbert (1977) lại dựa trên các phản ứng hóa học, cắt đứt sợi đôi DNA tại vị trí đặc biệt. (xem thêm Sinh học phân tử, Hồ Huỳnh Thùy Dương, NXB Giáo Dục, 1997)
Nhưng phương pháp hóa học đã không còn được sử dụng rộng rãi ngày nay do những độc tính mà các hoá chất có thể gây ra với người sử dụng. Vì vậy hiện chỉ còn mỗi phương pháp của Sanger là được tín nhiệm. Phương pháp của Sanger còn được biết với tên gọi khác là giải trình dideoxy. Để hiểu được quy trình dideoxy, có lẽ chúng ta cần nhắc lại hai bước cơ bản trong quá trình tổng hợp DNA:
- đầu tiên, sự tổng hợp của sợi DNA không thể bắt đầu từ một cách ?otùm lum?o mà phải có những điều kiện nhất định có chọn lựa. Trước tiên, mồi sẽ gắn lên khuôn. Sự tổng hợp sợi DNA mới sẽ diễn tiến bằng cách gắn thêm các base vào mồi và các base được gắn thêm phải tuân thủ quy tắc ?obắt cặp bổ sung?o với sợi khuôn. Do vậy, khi chúng ta có một mồi gắn lên ở một ví trí đặc biệt đã được chỉ định trước, thì chúng ta có thể đảm bảo rằøng tất cả các sợi DNA mới tổng hợp sẽ được tạo thành từ cùng một điểm khởi sự trên sợi khuôn.
- Thứ hai, việc gắn thêm base lên sợi DNA mới tổng hợp sẽ được thực hiện thông qua việc tạo thành khung phosphoester đồng hóa trị giữa gốc 5?T-phosphate của sợi DNA mới (sợi DNA bị gắn thêm base) và nhóm 3?T-OH của base tự do (tức base sẽ bị kéo vào sợi mới). Cơ chất tham gia phản ứng này chính là một 5?T-dNTP, ví dụ một deoxynucleotid có 3 nhóm phosphate ở vị trí 5?T của đường deoxyribose;2 trong số 3 phosphate này sẽ bị loại đi khi phản ứng xảy ra.
Thành phần đường của các hợp chất tự nhiên thường là 2?T-deoxyribose khá chuyên biệt. Nghĩa là nó không có nhóm hydroxyl tại vị trí 2?T (điều này cần phân biệt với đường ribose tham gia trong phân tử RNA). Nhưng nó lại có một nhóm 3?T-OH, đó chính là điều kiện cần thiết để tạo khung sườn phosphodiester khi một base mới muốn gắn vào thêm. Như vậy, câu hỏi đặt ra là, điều gì sẽ xảy ra nếu chúng ta sử dụng một đường thiếu nhóm 3?T-OH ví dụ dẫn xuât của 2?T, 3?T- dideoxy, một ddNTP? Điều xảy ra là gốc đường ?okhuyết tật?o này vẫn gắn được vào gốc đường trước đó thông qua khung sườn phosphodiseter như đã nói, nhưng do không có gốc 3?T-OH nên nó lại không thể tạo phản ứng liên kết mới với bất kỳ một gốc đường nào khác. Nghĩa là không một base nào có thể được gắn vô với anh chàng có gốc đường ?okhuyết tật?o này. Nói dễ hiểu, một người dùng tay phải của mình để nắm tay trái người kia để hình thành một chuỗi người. Một anh chàng cụt tay trái vẫn có khả năng dùng tay phải của mình để nắm người đằng trước, nhưng sẽ không ai nắm được anh ta vì anh ay bị thiếu tay trái. Đến đây, sự sinh tổng hợp DNA coi như chấp dứt.
Bằng cách lợi dụng đặc tính trên mà Sanger đã đưa ra phương pháp đọc trình tự của mình. Thông thường, hỗn hợp dNTP là dATP, dTTP, dGTP va dCTP được sử dụng để tham gia phản ứng tổng hợp DNA. Do vậy, nếu chúng ta thêm vô hỗn hợp này một dẵn xuất dideoxy, ví dụ thay thế dATP bình thường bằng dẫn xuất 2?T,3?T dideoxy có đánh dấu gọi là ddATP, khi đó quá trình tổng hợp DNA sẽ ngừng lại khi ddATP bị gắn vào sợi DNA đang được kéo dài. Lưu ý, hỗn hợp dNTP vẫn có đủ 4 thành phần dATP, dTTP, dGTP va dCTP và có thêm sự hiện diện của ddATP. Phản ứng được thực hiện lại, nhưng thêm ddGTP; và cứ như vậy, chúng ta có 4 phản ứng riêng biệt với sự tham gia?ophá đám?o của 4 ddNTP khác nhau.
Quay trở lại trường hợp có sự hiện diện của ddATP, chúng ta thấy đầu tiên, ta giả sử có một T trên sợi khuôn, nghĩa là trên sợi đang tổng hợp phải là vị trí của A. Nếu ở vị trí này bị ddATP gắn lên thì quá trình tổng hợp sợi DNA chấm dứt. Nhưng nếu dATP được gắn vô, thì quá trình tổng hợp sẽ tiếp tục. Chuỗi DNA sẽ tiếp tục đến vị trí T kế tiếp, và kịch bản lại lặp lại như trên. Do vậy, trong hỗn hợp tổng hợp sau cùng, chúng ta sẽ thu nhận được nhiều phân tử DNA có độ dài khác biệt và tất cả chúng đều chấm dứt tại vị trí A. các sản phẩm có độ dài khác nhau này có thể phân biệt và quan sát đễ dàng trên gel polyacrylamide biến tính (điều kiện biến tính được sử dụng nhằm tránh hiện tượng các sợi DNA sẽ tạo các cấu trúc bậc hai bất thường khiến cho việc di chuyển của chúng trên trường diện di bị sai lệch, các điều kiện kỹ thuật chi tiết cho việc chạy điện di gel polyacremide không bàn ở đây). Kết quả quan sát trên trường điện di là một loạt các vạch có chiều dài khác nhau (sợi ngắn nhất chạy nhanh nhất), và tất cả đều có vị trí tận cùng là T trên sợi khuôn. Lặp lại thí nghiệm với ddGTP (ddTTP, ddCGP) chúng ta sẽ thu được 4 đường diện di, và từ đó có thể suy luận ra trình tự của sợi DNA.
Với kỹ thuật đọc DNA bằng tay, các phản ứng còn có thể thực hiện với một trong 4 dNTP được đánh dấu bằng đồng vị phóng xa, do vậy khi đọc gel với phim tia X quang, kết quả hiện lên là một vạch màu đen trên nền trắng. Do các mảnh nhỏ nhất sẽ di chuyển nhanh nhất, khi đó chúng ta sẽ đọc kết quả từ dưới lên trên.
Đọc trình tự bằng các máy tự động
Ngày nay, hầu như tất cả các DNA được đọc là nhờ vào mày. Mặc dù cơ sở khoa học là như nhau, nhưng mỗi biến thể của mỗi dạng máy khác nhau sẽ có nhiều điểm khác nhau, mà chủ yếu là khác biệt về phương cách dò tìm các chỉ thị đã được đánh dấu trước đó. Chỉ thị đánh dấu có thể là primer hoặc ddNTP, chúng sẽ được gắn thêm với thuốc nhuộm phát huỳnh quang. Chất nhuộm sẽ gắn vào ddNTP, ví dụ màu đỏ gắn cho ddATP, màu xanh gắn cho ddCTP, màu vàng gắn cho ddGTP và màu xanh dương gắn cho ddCTP. Phản ứng tổng hợp xảy ra với sự hiện diện của cả 4 ddNTP này bên cạnh sự có mặc hiển nhiện của 4 dNTP tương ứng. Sau khi phản ứng chấm dứt, tất cả sản phẩm sẽ được đưa lên cùng một làn đọc của máy và hiển nhiên các sản phẩm có độ dài nhỏ nhất lại sẽ được nhận diện sớm nhất. Do vậy, thay vì chạy trên gel polyacremide vừa tốn thời gian lại có nhiều sai sót khi đọc kết quả, máy đọc trình tự sẽ sử dùng chùm sáng laser để đọc (nhận diện) chất phát huỳnh quang phát ra chất nhuộm gắn lên một sản phẩm khi sản phẩm này chạy qua một điểm cố định (điểm cố định đồng nghĩa vơi nơi mà hệ thống dò tìm được thiết lập). Trình tự thu được sẽ chuyển vào máy tính để một phần mềm chuyên dụng xử lý kết quả.
Nếu chúng ta đánh dấu cho primer thì tất cả sản phẩm thu được sẽ cùng nhuộm với cùng một thuốc nhuộm, do vậy ta phải sử dụng 4 làn khác nhau. Tuy nhiên, nếu chúng ta đánh dấu cho 4 ddNTP khác nhau với 4 thuốc nhuộm khác nhau thì phản ứng tổng hợp có thể chỉ thực hiện trong 1 ống nghiệm và chỉ cần 1 làn là đủ, như vậy máy sẽ được nâng công suất rất nhiều. Dựa trên cơ sở này mà người ta đã chế tạo nhiều robot tự động đọc các đoạn gene lớn, chẵng hạn như gene người, phần này không đề cập ở đây.
Mặc dù có nhiều điểm khác và giống nhau trong tiến trình đọc trình tự ở cả hai phương pháp thủ công và bằng máy, cả hai phương pháp này gặp phải đều gặp phải một số trở ngại có vẻ gần giống nhau ví dụ như sự hiện diện phân tử DNA có cấu trúc bậc hai (vòng kẹp tóc) có thể gây nhiễu cho quá trình tổng hợp DNA? Do vậy, để giải quyết các lỗi tìm ẩn, người ta phải can thiệp bằng cách thay đổi điều kiện phản ứng; đọc trình tự các mảnh nhỏ khác nhau mà các mảnh này có các vùng gối đầu lên nhau (như các tấm ngói) với những đoạn DNA mà người ta nghi là có vấn đề khi đọc trình tự; hoặc người ta đọc cả hai sợi của DNA thay vì một sợi. Các kết quả thu được sẽ giúp đọc trình tự với độ chính xác cao nhất.

Em hơi ngạc nhiên khi thấy anh bảo chức năng proofreading của Taq được sử dụng trong sequencing nên mới gửi câu hỏi. Đọc xong mấy bài hướng dẫn, em không thấy chỗ nào có nói tới đặc tính này cả. Riêng hai phương pháp của Maxam Gilbert và Sanger em đều đã biết và đã được học ở trường.
Mong anh chỉ rõ hơn người ta đã lợi dụng khả năng này của Taq như thế nào trong việc giải trình tự DNA . !

*** Theo em được biết Taq không phải chỉ gắn 1 Nu (A) vào đầu sản phẩm PCR mà là poly A. Chính lợi dụng poly A này mà người ta có thể gắn sản phẩm PCR vào vector có đầu poly T tạo vector mang đoạn DNA mong muốn
*** Còn lợi dụng đặc tính này vào sequencing có lẽ (cái này theo em suy nghĩ thôi nhé) Người ta sẽ gắn poly T vào poly A như một primer từ đó tiến hành đọc trình tự theo một trong hai phương pháp nêu trên.
*** Theo một cuốn sách em đọc được thì muốn đọc trình tự người ta gắn đoạn gen đó vào M13 sau đó mới đọc trình tự. Có cần thiết phải làm như vậy không nhỉ???
*** Ta có thể loại bỏ đặc tính proofreading của Taq không ???
Mong các anh chị có kinh nghiệm chỉ giáo vì tụi em chỉ đọc sách mà thôi

- Taq chỉ gắn một A vào cuối sản phẩm PCR thôi chứ không gắn polyA. Điều này rất dễ kiểm chứng nếu bạn đọc dữ liệu của một máy giải trình tự, tín hiệu của nucleotide A rất mạnh ở vị trí cuối cùng của sản phẩm PCR. Đây cũng là một tín hiệu để máy tính xử lý biết đó là kết thúc của đoạn sản phẩm PCR cần giải trình tự.
- Việc lợi dụng đặc tính của Taq thì theo tôi nghĩ chính là lợi dụng việc Taq không có khả năng proofreading nên những đoạn DNA được tổng hợp dở chừng do có ddNTP ở cuối sẽ giữ nguyên như vậy, không được sửa chữa gì cả, nhờ đó ta mới có một hỗn hợp nhiều đoạn DNA với kích thước chệch nhau từng 1 nucleotide để mà giải trình tự.
- Thường việc gắn vào M13 là để tạo dòng trước khi giải trình tự. Nếu muốn giải trình tự bộ gen chẳng hạn, thì thường người ta sẽ cắt bộ gen đó thành nhiều mảnh gối đầu lên nhau (overlapping ends) rồi dòng hóa mỗi mảnh vào một vector (như trường hợp bạn đưa ra là M13), ta sẽ được một ngân hàng các dòng chứa bộ gen của con quan tâm, từ các dòng đó, người ta mới đem giải trinh tự từng dòng, rồi ráp lại với nhau (nhờ các đầu overlap) để ra trình tự nguyên bộ gen.
- Taq không có khả năng proofreading, nên chả cần phải mệt óc nghĩ cách loại bỏ. Pfu (lấy từ Pyrococcus furiousus) là một ví dụ về polymerase có khả năng proofreading.

Trả lời thế này mới là trả lời chứ ! Đúng phong cách và trình độ của một người làm thực nghiệm. Nhưng có chắc là nếu cứ sử dụng Taq có chức năng proofreading thì phương pháp Sanger coi như không cho kết quả hay không?
Em hỏi thêm một câu về PCR, đó là một phương pháp chống tạp nhiễm chéo giữa các amplicon của các đợt PCR khác nhau. Người ta dùng dUTP thay cho dTTP trong hỗn hợp dNTP. Sau đó dùng uracil-N-glycosylase (UNG) xử lý. Vấn đề ở đây là làm thế nào Taq có thể dùng Thimine khi đứng đối mặt với Adenin ???

Câu hỏi này rất hay, và tôi cũng đã có ý định tìm hiểu về chuyện này khi trả lời bạn về việc lợi dụng Taq không có proofreading.
Tôi có đọc một số bài về cơ chế proofreading, và rất tiếc tôi phải trả lời cho câu hỏi của bạn là nếu dùng proofreading polymerase trong phương pháp Sanger thì, theo tôi, cũng chả sao cả, kết quả vẩn bình thường. Nguyên lý để kích hoạt hoạt tính 3''-5'' exonuclease của DNA polymerase III (đây là DNA polymerase của E. coli, là mô hình được nghiên cứu nhiều nhất, các DNA polymerase khác có chức năng proofreading cũng hoạt động tương tự) là phải có sự thay đổi về cấu hình của mạch DNA đang tổng hợp (do bắt cặp không đặc hiệu, mismatch). Khi có lỗi xảy ra trong lúc tổng hợp, tức là polymerase gắn nucleotide không bổ sung với mạch khuôn vào mạch đang tổng hợp, mạch đôi DNA lúc này bị chênh lên ở đầu 3'', không thuận lợi cho hoạt động kéo dài, làm dừng phản ứng polymerase. Sự thay đổi cấu hình này thuận tiện cho việc đưa mạch đơn DNA đang tổng hợp vào trung tâm hoạt động có hoạt tính 3''-5'' exonuclease, nhờ đó nucleotide "lạc loài" này được cắt bỏ và sự tổng hợp tiếp tục diễn ra.
Đối với trường hợp ddNTPs, cấu trúc của nó rất giống với các dNTPs khác, chỉ thiếu mổi nhóm -OH ở vị trí 3''. Vì thế, theo tôi, khi được gắn vào mạch DNA, nó không gây ra một thay đổi đáng kể nào về mặt cấu hình để kích hoạt hoạt tính proofreading của polymerase. Do đó, cho dù có dùng proofreading polymerase cho phản ứng Sanger thì kết quả vẫn tương tự như dùng Taq.
Đây chỉ là lý giải của tôi sau khi đọc rất sơ lược về cơ chế proofreading. Hy vọng nó giúp bạn có thêm hứng thú để tiếp tục tìm hiểu về những vấn đề như thế này...