PCR

Phương pháp PCR
1 Nguyên tắc phản ứng PCR

Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) được Karl Mullis và cộng sự (Mỹ) phát minh năm 1985 và kể từ đó đã tạo nên một tác động to lớn đối với các nghiên cứu sinh học trên toàn thế giới. Ðây là phương pháp in vitro sử dụng các cặp mồi để tổng hợp số lượng lớn các bản sao từ một trình tự DNA đặc biệt dựa trên hoạt động của enzyme polymerase. Hiện nay, phương pháp này đã được sử dụng rộng rãi trong nhiều nghiên cứu sinh học phân tử, vi sinh, kiểm nghiệm, chẩn đoán?để phát hiện mầm bệnh, vi sinh vật, virus, phân type, tạo đột biến gene và xác định các mối quan hệ họ hàng về di truyền của các loài động vật và thực vật.

Phương pháp PCR dựa trên hoạt động của DNA polymerase trong quá trình tổng hợp DNA mới từ mạch khuôn. Tất cả các DNA polymerase đều cần những mồi, là những đoạn DNA ngắn có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn. Ðoạn mồi này sau đó sẽ được nối dài ra nhờ hoạt động của DNA polymerase để hình thành một mạch mới hoàn chỉnh. Trong một phản ứng PCR để khuyếch đại một trình tự đặc biệt nào đó, ta cần phải có những thông tin tối thiểu về trình tự đó để thiết kế các mồi bổ sung ở hai đầu mạch bao gồm một mồi xuôi (sense primer) và một mồi ngược (antisense primer) so với chiều phiên mã của gene. Một khi được cung cấp hai mồi bổ sung ở hai đầu, phản ứng sẽ cho ra hàng loạt bản sao của đoạn DNA nằm giữa hai mồi đó.

Một phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm ba giai đoạn:

- Giai đoạn biến tính (denaturation): trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tm của phân tử, thường là ở 94,C - 95,C trong vòng 30 giây ?" 1phút.

- Giai đoạn lai (anealation): ở giai đoạn này, nhiệt độ được hạ thấp hơn Tm của các mồi cho phép các mồi bắt cặp với khuôn. Trong thực nghiệm, nhiệt độ này dao động trong khoảng 40,C ?" 70,C, tùy thuộc Tm của các mồi sử dụng và kéo dài từ 30 giây ?" 1 phút.

- Giai đoạn tổng hợp (elongation): nhiệt độ được tăng lên đến 72,C giúp cho DNA polymerase sử dụng vốn là polymerase chịu nhiệt hoạt động tổng hợp tốt nhất. Thời gian tùy thuộc độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại, thưòng kéo dài từ 20 giây đến nhiều phút.

Trong phản ứng PCR, chu kỳ ba giai đoạn sẽ được lặp lại nhiều lần, mỗi lần làm tăng số lượng bản sao lên gấp đôi. Sự khuếch đại của phản ứng là theo cấp số nhân và theo tính toán, sau 30 chu kỳ, sự khuếch đại sẽ là 106 so với số lượng bản mẫu ban đầu.

2 Các nhân tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR
Mồi và nhiệt độ lai:

Mồi là chỉ tiêu quan trọng nhất để đạt được sự khuếch đại đặc trưng và có hiệu quả cao. Trình tự của mồi được chọn sao cho:

- Không thể có sự bắt cặp bổ sung giữa mồi xuôi (sense) và mồi ngược (antisense) và cũng không có những cấu trúc ?okẹp tóc?do sự bắt cặp bổ sung giữa các phần khác nhau của một mồi.

- Tm của mồi xuôi và mồi ngược không quá cách biệt nhau.

- Thành phần nucleotide của các mồi phải cân bằng tránh lặp lại nhiều lần các cặp GC.

- Các mồi được chọn phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại, không trùng với các trình tự lặp lại trên gene.

- Trình tự nằm giữa hai mồi xuôi và ngược không quá lớn, phản ứng PCR sẽ tối ưu trên những trình tự nhỏ hơn 1kb.
DNA mẫu:

Kết quả phản ứng PCR lệ thuộc rất lớn vào DNA mẫu.

- Phản ứng PCR tối ưu khi DNA thật tinh sạch. Tuy nhiên nhiều kỹ thuật chẩn đoán bằng PCR vẫn đạt kết quả đối với DNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào hoặc ngay cả mẫu DNA không được bảo quản tốt

- Phản ứng PCR tối ưu cũng lệ thuộc vào lượng bản mẫu. Lượng DNA mẫu sử dụng cũng có khuynh hướng giảm (1µg xuống còn 100ng) khi sử dụng các DNA polymerase cho hiệu quả cao. Việc giảm lượng mẫu còn hạn chế được sự khuếch đại ?oký sinh? tạo những sản phẩm phụ không mong muốn.

Enzyme:

Enzyme được sử dụng đầu tiên là đoạn Klenow của DNA polymerase I. Ðây là enzyme không chịu nhiệt nên thao tác phức tạp và hiệu quả thấp. Hiện nay, một số enzyme mới có hiệu quả hơn

- DNA ?" polymerase chịu nhiệt được tách chiết từ một vi khuẩn hiện diện trong suối nước nóng, Thermus aquaticus. Enzyme này được viết tắt Taq ?" polymerase.

- Tth polymerase tách chiết từ Thermus thermophilus, có khả năng hoạt động như một enzyme phiên mã ngược khi có mặt RNA khuôn và ion Mn2+; ngược lại, khi khuôn là DNA và có ion Mg2+, enzyme này lại xúc tác phản ứng khuếch đại DNA.

dNTP

Bốn loại nucleotid thường được sử dụng ở nồng độ là 20-200µM/mỗi nucleotide. Nồng độ cao hơn dễ dẩn đến sự khuếch đại ?oký sinh?. Sự mất cân bằng trong thành phần các nucleotide lại làm tăng các lỗi sao chép của polymerase.

Nồng độ ion Mg2+

Mg2+ là cofactor cho hầu hết các DNA polymerase, đặc biệt là các DNA polymerase chịu nhiệt thường dùng.

- Nồng độ Mg2+ quá thấp (<0,5mM) làm giảm phản ứng kéo dài mạch DNA do hoạt động của Taq polymerase bị ức chế.

- Nồng độ Mg2+ quá thừa làm ổn định sự bắt cặp sai của mồi với khuôn, dẫn đến nhiều sản phẩm không đặc hiệu.

- Nồng độ tối ưu của Mg2+ phải được xác định cho từng phản ứng qua nhiều thử nghiệm.

Số chu kỳ của phản ứng PCR

Trong thực tế, số lượng chu kỳ của phản ứng PCR không vượt quá 40 chu kỳ do hiệu quả khuếch đại giảm hẳn vì sự phân hủy và cạn kiệt các thành phần của phản ứng, sự xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế phản ứng, các bản sao vừa được tổng hợp không kết hợp với mồi mà bắt cặp với nhau?.

Concay paste len tu tai lieu cua nguoi khac

Chào concay,
Hình như là KARY MULLIS mà không phải Karl Mullis thì phải ?
Thân ái

"TỪ BI" OR NOT "TỪ BI" ?

cám ơn anh Dũng Tuấn , do sơ suất nên tên tác giả của PCR bị viết sai. tên đúng là Kary Mullis, năm phát minh là 1985

Những bài viết của bạn có chất lượng chuyên môn lắm. Bạn có thể cho biết nguồn tham khảo từ tài liệu nào không ?

Theo tôi thấy bài này lấy chủ yếu từ cuốn "Sinh học phân tử" của cô Hồ Huỳnh Thùy Dương, với một chút xíu chỉnh sửa câu chữ.
Tôi thường hay để ý chữ nghĩa nên thấy như vầy:
Không hiểu sao tôi không thích dùng thuật ngữ là sense và antisense primer, nó luôn gây cho tôi cái gì đó lộn xộn, hay lẫn lộn. Chắc là nhiều người giống tôi hay sao chứ dạo này tôi thấy tài liệu dùng toàn chữ Forward và reverse primer, nghe nó hình tượng và dễ hiểu hơn nhiều.
Tôi có thắc mắc thế này: Trong phần nhân tố ảnh hưởng, có nói là thành phần nucleotide của mồi phải cân bằng, tránh lặp lại GC nhiều, trong khi đó tôi được biết là trong thành phần nucleotide của mồi khi thiết kế thì luôn ưu tiên thành phần GC của nó phải lớn hơn 50%, để bảo đảm sự bắt cặp ổn định của mồi vào khuôn, tăng tính đặc hiệu, vậy thì chuyện tránh lặp lại GC nhiều là thế nào? Vả lại theo tôi biết thì nếu thành phần GC của mồi lớn hơn 70%, người ta vẫn khắc phục được bằng cách cho thêm betaine hay DMSO giúp hạ thấp Tm của mồi.
Everything has two sides or more.

01- Tôi đã có viết, bài PCR này lấy từ tài liệu người khác, còn người này lấy từ đâu thì tôi không quan tâm (mặc dù tôi thừa biết là lấy từ quyển SHPT của Hồ Huỳnh Thùy Dương).
02- Chuyện thuật ngữ là vấn đề phức tạp và tế nhị, tôi không bàn cãi ở đây, mặc dù tôi vẫn dùng forward và reverse primer.
03- Tỷ lệ C+G thường phải là 60% để lực liên kết đủ mạnh. Việc tránh lặp di lặp lại CẶP CG là để tránh mồi sẽ bắt dính lên các đảo CpG là nơi mà có trình tự CG lặp đi lặp lại khá cao vốn phân bố rất nhiều trong bộ genome.
ConCay

Bác có thể cho em biết thêm về đảo CpG này được không, em đã đọc nhiều tài liệu đề cập đến nó, nhưng chưa kịp tìm hiểu coi nó là cái gì. Có phải nó cũng là một loại microsettelite? nó có vai trò gì đặc biệt quan trọng không, có ứng dụng gì không (marker cho gene nào đó chẳng hạn)
Everything has two sides or more.

Nếu có thời gian, bạn hãy thử tìm hiểu về đảo CpG xem sao, rồi viết những gì bạn đã đọc và hiều được, tôi sẽ giúp bạn đánh giá độ chính xác của thông tin. Có như vậy, bạn vừa năng cao được E vừa sở hữu được trí tuệ của mình lại vừa đóng góp bài viết cho cái "xó xỉnh" này.
Thân,
Concay

okie! Wait and see!
Khổ tui rồi, bị trúng kế khích tướng của bác ConCay
Everything has two sides or more.

Thông thường lý thuyết là vậy, nhưng thực tế thì chỉ cần tỉ lệ G+C từ 40-60% là được, đôi khi người ta cũng thiết kế mồi có tỉ lệ G+C chỉ khoảng 38%.

Tuỳ thuộc vào mục đích PCR mà lựa chọn chiều dài đoạn trình tự. Đối với những phản ứng PCR sequencing với kích thước lớn >1kb thì phải sử dụng một loại đặc biệt để phản ứng tốt hơn ( tránh sai sót trong quá trình hoạt động của enzyme polymerase, tỉ lệ sai sót của Taq khoảng 1/10000).