PCR

Allright cho rằng
============
Tuỳ thuộc vào mục đích PCR mà lựa chọn chiều dài đoạn trình tự. Đối với những phản ứng PCR sequencing với kích thước lớn >1kb thì phải sử dụng một loại đặc biệt để phản ứng tốt hơn ( tránh sai sót trong quá trình hoạt động của enzyme polymerase, tỉ lệ sai sót của Taq khoảng 1/10000).
============
01. Phản ứng PCR là để khuyếch đại đoạn DNA cần nghiên cứu, lẽ đương nhiên là phải chọn lựa chiều dài đoạn trình tự tuỳ thuộc mục đích nghiên cứu rồi, có gì mà phải nói.

02. Còn cái "một loại đặc biệt" là cái gì đặc biệt?? Trình tự đặc biệt hay mồi đặc biệt hay enzyme đặc biệt?
a. nếu là trình tự đặc biệt thì nghĩa là sau, giả sử rằng cần sequecing một đoạn DNA chưa biết thì làm sao biết nó đặc biệt chỗ nào để lựa chọn; còn nếu đã biết trước một DNA (đã sequecing rồi) có những đoạn nào đó đặc biệt thì có cần phải sequencing nữa không? Cũng giả sử rằng rằng với những DNA đã được sequencing (tức có dữ liệu trình tự đầy đủ), nay người ta chỉ cần sequecing trên một đoạn DNA này để test một cái vớ vẩn nào đó (ví dụ như SNP) thì đâu có cần dài tới 1kb, thì như vậy cái ý nghĩa đặc biệt nằm chỗ nào??
b. nếu là đoạn mồi đặc biệt thì có thể cho biết về cái mồi ĐẶC BIỆT này được không?
- làm sao thiết kế?
-Số lượng, tỷ lệ thành phần của các nu trong mồi.
-tại sao nó có tính "đặc biệt" trong việc loại bỏ (hoặc hạn chế đến mức thấp nhất) những sai sót do tag polymerase gây nên?
c. Nếu cái đặc biệt là enzyme thì đó là enzyme gì???
3. Cũng tiện thể hỏi luôn, tỷ lệ sai sót trong PCR do tag polymerase gây ra là khá cao, có cách nào khắc phục không (về mặt phương pháp luận và kỹ thuật).
Concay

Tôi nghĩ ý của Allright là dùng một loại DNA polymerase đặc biệt đó, có thể là một loại Taq 2rd version, đã được biến đổi di truyền (chẳng hạn Sequencing Grade Taq DNA Polymerase Cat.# M2031, M2035, M2038, của Promega)
Ðể khuyếch đại một đoạn DNA lớn và giảm sai sót do Taq, người ta dùng Long range PCR, trong đó có 2 DNA polymerase được dùng, 1 cái chính (Taq chẳng hạn) không có khả năng proof reading, và một cái phụ (Pwo chẳng hạn) có khả năng 3?T-5?T proofreading.
Everything has two sides or more.

Khà khà, đúng là các nhà khoa học, thấy sai thì luôn thắc mắc nhưng thấy đúng thì không thèm thắc mắc nữa.
Đánh sai một vài chữ cho bà con sửa lưng chơi í mà, thông cảm nhe.
Tất nhiên là tuỳ theo mục đích mà PCR đoạn dài hay đoạn ngắn, nhưng trong bài viết trên chỉ đề cập đến việc phản ứng tối ưu với trình tự <1kb, trong khi có thể tối ưu với trình tự dài đến 35kb.
Taq polymerase là một loại enzyme thông dụng nhất hiện nay trong PCR. Taq polymerase có thể khuếch đại tốt một đoạn dài đến 3kb, trong một số trường hợp có thể lên tới 10 kb. Tôi có thể tối ưu phản ứng để khuếch đại một đoạn dài khoảng 2.5kb bằng Taq được chứ. Thế nhưng Taq có một tỉ lệ sai sót cao là 2.6/100000, nên càng về kéo dài cuối cùng thì Taq càng dễ dàng gây ra sai sót.
Do đó trong quá trình PCR để sequencing hay cloning người ta sử dụng enzyme polymerase sao cho có độ chính xác cao.

Người ta tìm ra cái loại Pwo, là enzyme có nguồn gốc từ Pyrococcus woesei, tái tổ hợp vào trong E.coli. Pwo có độ chính xác cao hơn hẳn Taq (sai sót của Pwo là 0.32/100000) thế nhưng anh ta có tốc độ khuếch đại chậm và không thể khuếch đại trình tự dài hơn 3Kb. Vì thế người ta nghĩ đến việc sống và làm việc chung giữa Taq và Pwo tạo thành một hỗn hợp enzyme (enzyme blend) sử dụng trong PCR.
Như trong Expend Hight Fidelity PCR system.
Sự trộn enzyme này giúp cho hoạt động DNA polymerase trong PCR có hiệu quả hơn, Pwo khả năng 3?T-5?T proofreading. có thể minh hoạ theo hình sau.
như vậy độ chính xác của phản ứng được tăng lên.
Hình bên chỉ có Taq, Taq không tiếp tục tổng hợp sau khi gắn sai.
Hình bên có Taq và Pwo, Taq tiếp tục hoàn thành công việc sau khi được Pwo cắt bỏ phần sai.

Sloth

ã Sỏằ'ng chung vỏằ>i nhau nên Taq và Pwo có thỏằf hoỏĂt 'ỏằTng vỏằ>i sỏằ thay 'ỏằ.i lỏằ>n 'iỏằu kiỏằ?n phỏÊn ỏằâng.( vd: có thỏằf hoỏĂt 'ỏằTng tỏằ't vỏằ>i nỏằ"ng 'ỏằT Mg2++ tỏằô 1.5 õ?" 5 mM.)
ã ĐỏằT chưnh xĂc 'ỏĂt 'ỏn 0.85/100000.
ã Khỏch 'ỏĂi 'ặỏằÊc 'ỏằ'i vỏằ>i lặỏằÊng DNA mỏôu nhỏằ.
ã Thỏằc hiỏằ?n tỏằ't hặĂn PCR 'Ănh dỏƠu.
ã Ít bỏằi sỏằ' lặỏằÊng chu kơ ưt vơ giỏÊm sỏằ tỏĂo thành sỏÊn phỏâm không 'úng kưch thặỏằ>c (truncated) và tfng 'ặỏằÊc lặỏằÊng sỏÊn phỏâm 'úng kưch thặỏằ>c.
ã Có 'ỏằT chưnh xĂc cao khi PCR vỏằ>i nhỏằng trơnh tỏằ giàu GC hay nhỏằng trơnh tỏằ có nhiỏằu 'oỏĂn lỏưp lỏĂi)
ã Có thỏằf khuỏch 'ỏĂi trơnh tỏằ dài 'ỏn 9.3 kb, tuy nhiên tỏằ'i ặu 'ỏằ'i vỏằ>i trơnh tỏằ <= 5kb.
phỏĐn >5 kb mỏằi ngặỏằi tỏằ tơm thêm nhâ. Tôi lặỏằi lâm. Nói chung nó câng là cĂi dỏĂng cạng sỏằ'ng và cạng làm viỏằ?c cỏằĐa cĂc loỏĂi DNA polymerase.

Sloth

MồI
Mồi dùng trong PCR đoạn dài này thì khác một chút so với mồi dùng trong PCR thông thường. Thông thường Taq chỉ cần nhận biết 1-2 base ở đầu 3?T, sau đó có thể mismatch 1-2 base.
vd : DNA?"ctgacgatgtacgatggtg primer-ctgacgatgtatgatcatg.
Tuy nhiên do khả năng proofreading của Pwo nên mồi phải thiết kế tốt hơn, vì với mồi như trên thì nó sẽ bị Pwo cắt béng đi mất, do đó mồi thiết kế phải bắt cặp tốt ở đầu 3?T, nếu có mismatch thì phải cách đầu 3?T từ 6-9 bases.
vd: DNA?"ctgacgatgtacgatggtg primer?"ctgacgtagtatgatggtg
Dùng trong PCR những trình tự dài thì phải có nhiệt độ Tm khá cao, 61-68 oC ( so với những đoạn ngắn <65oC). Điều này sẽ giúp cho phản ứng đạc hiệu hơn.
Độ dài trình tự là 20-30 bases ( ở đoạn ngắn tối ưu là 18-25 bases) như vậy mới đáp ứng được yêu cầu về Tm.

DNA mẫu
Tùy theo từng kích thước cần khuếch đại mà ta tối ưu nồng độ DNA nhưng phải theo mức giới hạn sau:
_ <500ng đối với DNA bộ gene của người (có thể tính cả động vật).
_ 1-10 ng đối với DNA vi khuẩn.
_ 0.1- 1 ng đối với plasmid DNA.
Loại RNA ra khỏi mẫu vì RNA có thể bắt lấy Mg2+ làm giảm lượng MG2+ tự do.
Mẫu DNA chỉ giữ ở nhiệt độ 4oC, không nên để đông vì khi giải đông sẽ làm đứt gẫy DNA.
Các thành phần trong phản ứng cần thiết , cần phải tối ưu bằng thực nghiệm : dNTP, Mg2+, pH (8.3-9.2), DNA polymerase concentration, nồng độ mồi ...
Chúng ta còn có thể nêm vào trong món súp PCR một số thành phần phụ gia ( phụ trợ) khác:
Đối với những trình tự có nhiều GC hay những trình tự DNA quá dài, ta cho thêm vào DMSO hay betaine sẽ hoạt hoá polymerase cũng như làm giảm nhiệt độ Tm của DNA mẫu . Nếu lượng DMSO quá cao sẽ làm giảm lượng polymerase trong phản ứng.
Nếu lượng DNA ít hay có nhiều thành phần có thể gây ức chế phản ứng thì có thể sử dụng thêm Tween 20. Tween 20 làm tăng khả năng ổn định của polymerase và tăng tạo sản phẩm.
Trong khi tiến hành phản ứng trong thermal cycler:
- Tăng nhanh sự trao đổi nhiệt giữa các thành phần phản ứng với heating block. Bằng cách sử dụng 0.2 microlit tubes có thành mỏng và thể tích phản ứng <=50 microlit.
- giảm thời gian biến tính DNA (92-95oC) đến mức tối thiểu để giảm sự đứt gãy DNA.
- Tối ưu hoá số lượng chu kì ( thường <35 chu kì). giúp làm giảm smear (sản phẩm không mong muốn) trong sản phẩm. (đây chỉ là một trong những cách làm giảm smear).
Trên đây là một số thông tin về PCR. Những thứ trên đây đã có sự chứng thực bằng thực nghiệm. Nhưng trong từng điều kiện cụ thể thì phải thực hiện tối ưu lại nếu phản ứng diễn ra không tốt.

Sloth

Bác allright post xong phải kiểm tra lai chứ, ai lại post một bài 2 lần

kích thước sequencing cũng tuỳ theo mục đích nghiên cứu, nếu nghiên cứu về đột biến mà biết nó nằm ở đâu thì quá dễ. Còn những người làm nghiên cứu về đột biến điểm gây bệnh, đột biến đó chưa biết là ở đâu thì phải sequencing toàn bộ gene đột biến để nghiên cứu chứ.
Tại sao phải sequencing trình tự dài như thế trong khi người ta đã giải trình tự những gene đó rồi, thì đặt vấn đề về sự đa hình về kiểu gene trong cùng một loài ở những vùng địa lý khác nhau. sự đa hình về kiểu gene có thể có những biểu hiện kiểu hình khác nhau hay giống nhau.

Không hiểu sao có vài thằng nào điên mà giải tới cả trăm trình tự 16S rRNA của Bacillus anthacis, lại còn có mấy tên khùng nào giải tới cả ngàn trình tự chỉ có mỗi một gene 16S rRNA của Neisseria Meningitidis vậy ta. Tui cũng điên giống mấy thằng đó quá.. Tui ghét mấy thằng đó bởi nó giải chỉ có 1.5kb làm cho tui khổ cực mấy bữa để tìm mà chẳng được kết quả gì. Thiếu của tui đến vài chục bases, mai kiếm tiền tui giải dư ra trăm bases cho bà con xài chơi..
Nợ núi sông chưa trả
Nợ hà bá chưa đòi
lúc xuống chó lúc lên voi
Có chi mà sợ bởi đâu có đua đòi lợi danh.
Được Vo_niem sửa chữa / chuyển vào 02:45 ngày 28/04/2003

Các câu hỏi tôi đặt ra thì phần lớn tui đã có câu trả lời. Chuyện tôi đặt vấn đề "độ dài đặc biệt trong PCR" chỉ để hỏi rõ cái gọi là "đặc biệt " gì gì đó của allright đưa ra. Vì chuyện PCR hay giải trình tự chẳng có gì là lạ với tôi cả, tôi đang làm về Molecular Evolution (phylogenetic approach) nên việc phải đi sequencing những gene đặc trưng của quá trình sống và tiến hóa (ribosome là một ví dụ) rồi mò mẫm sắp xếp chúng lên mấy cái tree thì tôi chẳng có gì là lạ.
Concay

Bác bắt bẻ từ ngữ của allright làm gì cho nhọc thân. Bác không thấy nick của nó là 3 phải hay sao, lại còn kí tên là lười nữa chứ.
Chắc là cu cậu lười gõ lại nên mới "kéo" cái enzyme polymerase xuống dưới. Đọc bài là thấy nói về enzyme không hà.