PCR

Tôi cũng là vua làm biếng, nhưng khi viết thì cũng nên cẩn thận, viết sai chính tả có thể tha thứ là do viết lẹ viết nhanh chứ viết sai ý, thiếu ý thì rất mệt mỏi cho người đọc.
Concay

Những thành phần nào cần thiết nào cho sự sao chép, tại sao?
-Giai đoạn biến tính (denaturation)
Tại sao phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tm của phân tử, thường là ở 94,C - 95,C trong vòng 30 giây ?" 1phút (căn cứ này dựa trên tối ưu thực nghi ệm ?).
-Giai đoạn lai (anealation). Tại sao nhiệt độ phải hạ thấp hơn Tm. nhiệt độ cao như trên có cho phép mồi bắt cặp với khuôn không?
Tóm lại là em chả hiểu bản chất của các thao tác này là gì cả. Các hoá chất sử dụng có tác dụng như thế nào.
Vậy có bác nào hiểu thì viết dùm em được không.
Còn toàn bộ phần dưới miễn bàn (Toàn thực nghiệm và nhận xét của các bác cả).
Nguyễn Thanh Hải
Nguyễn Thanh Hải

Không lẽ chủ đề này bị khoá mà không thấy ai có ý kiến, ngay cả tác giả concay cũng không thấy phản hồi. Các bác trả lời đi, có thể là kiến thức phổ thông nên các cao thủ ngại không xuất bút. Nhưng quả thật các bác hãy nghĩ đến các thành viên, các thành viên ở mọi lứa tuổi, mọi trình độ.
Vài dòng như thế mong các bác tham khảo và làm giúp.
Nguyễn Thanh Hải

Bạn ơi, không phải chủ đề này bị khóa mà đa số các thành viên của box đã bị "khựng lại" vì có một số người đang ra sức khoe khoang vốn kiến thức của mình.
Tôi không sợ bị chê dốt, tôi không sợ bị người ta biết mình dốt, tôi hoan nghênh những người góp ý, sửa sai cho tôi. Nhưng tôi cũng có cảm xúc của mình, tôi dốt nhưng tôi không thích bị dè bỉu vì cái dốt của tôi, tôi dốt nhưng tôi không muốn mọi lời nói của tôi bị xét nét, vạch lá tìm sâu vì một số người nào đó có định kiến về sinh viên CNSH... thú thật đó là những ngại ngùng của tôi khi có ý trả lời câu hỏi của bạn. Nhưng thôi kệ, thà bị dè bỉu nhưng hy vọng câu trả lời của tôi giúp ích được phần nào cho bạn, thế là đạt mục đích rồi. Mong những thành viên khác đóng góp tích cực và sửa sai với tinh thần xây dựng, vậy là vui rồi.
Tôi xin có một số ý giúp bạn như sau:
- Thứ nhất, tại sao tại sao nhiệt độ ở giai đoạn biến tính là 94, 95 độ C: Mục đích của giai đoạn biến tính này là tách rời tất cả phân tử DNA có trong dung dịch thành mạch đơn để mồi có thể bắt cặp vào các mạch đơn này. DNA template (DNA mẫu, DNA mạch khuôn) có thể là DNA bộ gene của vi khuẩn, virus, DNA bộ gene của người (dài hơn rất nhiều) cũng có thể là plasmid... do đó để đảm bảo toàn bộ phân tử DNA đều tách thành mạch đơn hết thì cách dễ nhất là nâng lên nhiệt độ thiệt cao, để chúng nó tách hoàn toàn. Nếu bạn biết được DNA mẫu của bạn sẽ tách hoàn toàn ở nhiệt độ thấp hơn thì bạn có thể dùng nhiệt độ thấp hơn, tôi nghĩ chả sao, vấn đề là làm sao bạn biết được? phải tốn công khảo sát à, thôi tôi cứ dùng 95, cao nhất, chắc chắn là chúng nó sẽ tách hoàn toàn thế là xong.
Tại sao trong bài lại nói "phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tm của phân tử". Theo lý thuyết thì ở Tm, phân từ DNA sẽ biến tính. Nhưng nếu xem xét kĩ hơn, thì bạn phải biết Tm này là Tm gì, thường nó là Tm trung bình cho toàn phân tử, trong khi đó phân tử DNA lại rất dài, có những đoạn có thành phần G+C cao thì đoạn đó có Tm "địa phương" cao hơn Tm trung bình của phân tử, lại có những đoạn nhiều A+T, thế là Tm của chúng thấp hơn Tm của phân tử. Ðó là lý do tại sao muốn biến tính hoàn toàn phân tử DNA thường người ta sẽ cho nhiệt độ cao hơn Tm của phân tử. Ðể chắc ăn là biến tính hoàn toàn. Một điều nữa, cùng một nhiệt độ, nếu nhiều G+C thì sẽ cần thời gian lâu hơn để hai mạch tách ra và ngược lại khi giàu A+T, đó là lý do của thời gian biến tính có thể là 0.5-1 phút.
Bước biến tính này còn có tác dụng là tách những đoạn DNA mới được tổng hợp ra khỏi DNA mạch khuôn. Nếu với mục đích này thì Tm ở đây có thể hiểu là Tm của đoạn sản phẩm cần khuếch đại (ngắn hơn so với DNA bộ gene), nhưng nguyên tắc cũng như trên.
Theo nghiên cứu, nói chung, DNA nếu được đun trong dung dịch có lực ion nhỏ hơn 150mM NaCl thì nhiệt độ cần để biến tính hoàn toàn sẽ thấp hơn 100 độ C, đó là lý do tại sao ta thường xài nhiệt độ 91-97 độ C (bạn thấy đó, theo tác giả này thì khoảng nhiệt độ rộng hơn và có thể thấp xuống 91) (theo Ed Rybicki, Department of Molercular and Cell Biology, Univ. of Cape Town)
- Giai đoạn lai (annealation) (chữ anneal hai chữ "n"): nhiệt độ được hạ thấp hơn Tm của mồi để mồi nhanh chóng bắt cặp với khuôn. Thực ra, theo tất cả những bài mà tôi đọc được họ đều cho rằng xác định bằng thực nghiệm là tốt hơn cả. Có một quy tắc là nhiệt độ lai (Ta) sẽ thấp hơn nhiệt độ biến tính (Tm) thấp nhất khoảng 5 độ C (hai mồi có hai Tm khác nhau) (Innis và Gelfand, 1990).
Vậy Tm của mồi ở đâu mà có??? đa số là tính bằng phần mềm, bằng công thức, và có nhiều công thức, và các công thức có thể sai lệch nhau đến 10 độ C (tôi bị rồi, một cái ra 59, một cái ra 72 ). Do đó, chạy PCR bằng thực nghiệm với nhiều nhiệt độ biến tính khác nhau là cách tốt nhất để chọn Ta. Tính Tm bằng công thức theo tôi chỉ là một cách giúp ta ước chừng khoảng nhiệt độ nào để khảo sát mà thôi.
Có khi Ta của bạn khi thực nghiệm sẽ cao hơn Tm tính được, khi đó thì cứ theo kết quả thực nghiệm mà làm thôi. Quy tắc thấp hơn cũng chỉ là một quy tắc kinh nghiệm.
Còn về các hóa chất, dNTPs gồm 4 loại dATP, dGTP, dTTP, dCTP, cung cấp nucleotide cho Taq ráp vào. MgCl2 là một cofactor cho Taq, tôi thấy trong bài của bác Concay đã nói khá rõ rồi, nếu bạn không hiểu về chất nào thì nói cụ thể ra, tôi sẽ cố gắng giúp.
Everything has two sides or more.
Được weirdhobbit sửa chữa / chuyển vào 18:10 ngày 06/05/2003
Được weirdhobbit sửa chữa / chuyển vào 18:14 ngày 06/05/2003

1. tại sao DNA được biến tính khoảng 94-95oC:
Để trả lời câu hỏi này tôi phải dài dòng với bạn 1 chút. Khi bạn có 1 sợi DNA, bạn cho tia UV xuyên qua ở bước sóng 260nm bạn sẽ có một giá trị A nào đó; nhưng cũng là sợi DNA này, bạn xé ra làm đôi và cũng cho tia UV xuyên qua ở cùng bước sóng 260nm như vậy, bạn lại thu một giá trị B khác. Giá trị B cao hơn giá trị A khoảng 50%. Hiện tượng này gọi là hiện tượng siêu sắc (hyperchromic effect). Tức là ở điều kiện sợi đội, hai sợi đơn nằm kề gần như là phủ lên nhau nên giống như là chỉ có một sợi. Và khi DNA bị xé ra như vậy thì ta có ? 2 sợi.
Vào những năm thập kỷ 1960, sau khi người ta tìm thấy DNA, thì nhiều nghiên cứu về tính chất vật lý của DNA được tiến hành. Trong đó có việc tìm hiểu về sự biến tính của DNA. Biến tính trong trường hợp của DNA hiểu là chúng sẽ mất cấu trúc hai chiều; hai sợi đôi sẽ tách nhau ra.
Nhiều phương pháp ra đời như là dùng pH; lực ion; thuốc tẩy. Trong đó, giản đơn nhất là nhiệt độ. Bằng cách cho 1 lượng DNA như nhau rồi đun ở các khoảng nhiệt độ khác nhau, rồi thu mẫu và đo với tia UV ở bước sóng hấp thu 260nm người ta dựng được 1 đường cong chuẩn độ (tôi gọi là đường cong chuẩn độ vì tôi nhớ bên Hoá phân tích có cái đường cong này, hình load lên ko được, bạn thông cảm nhá). Trên đường cong đó người ta nhận thấy có một khoảng nhiệt độ cực hẹp khiến cho phân tử DNA bắt đầu biến tính hay là tan chảy ra. Khoảng nhiệt độ này nằm trong khoảng 85 đến 99oC (nhiều tài liệu khác nhau cho các khoảng khác nhau, nhưng lân cận là vậy).
Như vậy nhiệt độ biến tính của DNA lúc đầu là được xác định bằng thực nghiệm. Nhưng sau đó, thì bằng nhiều công cụ khác nhau người ta đưa ra công thức để tính Tm của 1 đoạn DNA đã biết
Tm = 69,3 + 0,41 (%G+C),
nếu cho rằng G+C khoảng 40% trong bộ gene người và Eucarytote thì Tm xấp xỉ là 85,7, gần đúng con số thực nghiệm.
Nếu bạn rảnh bạn có thể tìm thấy khá nhiều công thức tính Tm khác.
Người ta không cần phải đun nhiệt độ lên quá 99 hay 100oC vì có nhiều lý do, nhưng một trong những lý do đó là ? không cần thiết.
Về thời gian tại sao lại là 30-90s, cái này cũng do tối ưu thực nghiệm mà ra từ cái thí nghiệm nói trên.
Nhưng cũng để nói để bạn hình dung ra hiện tượng hợp tác và hiện tượng ?omắc nghẹn?o. Bạn gãy tưởng tượng bạn có 1 thân tre còn nguyên, bạn không thể dùng tay không mà tách đôi thân tre đó ra. Nhưng nếu dùng 1 con dao bén khẽ tách ở 1 đầu thân tre thì con dao cứ thế mà rọc suốt thân tre một cách dễ dàng (thắng như chẻ tre mà) đó là hiện tượng hợp tác. Nhưng cũng thân tre đó lại có những khúc mắc (khía hay đốt gì đó tuỳ tiếng địa phương) khiến cho bạn phải mạnh tay hơn một chút, tôi gọi đây là hiện tượng mắc nghẹn. Trên sợi DNA cũng vậy, khi bạn cần tách chúng ra, bạn cần lực phá hai liên kết hydro giữa A và T, còn với G và C là đến 3 liên kết hydro, một liên kết hydro cần 5 kcal mol-1;. Theo đó, bạn chỉ cần 1 lực vừa đủ thắng được lực liên kết hydro của các nu thành phần ở một vị trí nào đó trên DNA thì lặp tức hiệu ứng hợp tác cây tre như tôi vừa nói sẽ xảy ra, khiến cho 2 sợi đơn DNA sẽ bị xé toạt về hai phía. Nhưng trên sợi DNA có những vùng mà G và C tập trung khá cao, khiến cho việc biến tính gặp trục trặc vì vậy chúng cần lực mạnh hơn hay đúng ra là nhiệt độ cao hơn. Do vậy mà Tm thường chọn nằm trong khoảng biên độ hẹp cho phép DNA bị xé đôi thành 2 sợi. Nhiệt độ tối thiểu để DNA bắt đầu tách ra gọi là điểm cận dưới và nhiệt độ tối ra để DNA tách ra hoàn toàn gọi là điểm cận trên. Một số tài liệu còn chi tiết hơn cho rằng Tm chính là nhiệt độ để ?onhảy?o qua cái khúc xương G-C nói trên và nó thường là điểm nằm giữa của đoạn cong thẳng đứng trên đường cong chuẩn độ tức là nằm giữa điểm cận dưới và điểm cận trên
2- trong giai đoạn lai thì nhiệt độ nóng chảy lúc này thực chất lại là nhiệt độ nóng chảy của ? mồi, chứ không phải của genome. Tại sao lại có chuyện phải hạ thấp xuống vài độ thì, như tôi đã nói, Tm là điểm nằm giữa của đoạn cong thẳng đứng trên đường cong chuẩn độ. Ta lấy Tm trừ đi vài độ để tìm điểm cận dưới mà thôi. Nếu ta để nhiệt độ bằng với nhiệt độ Tm, tức là nhiệt độ tại điểm giữa thì sự liên kết trở lại giữa primer và phần đích của chúng thực sự là không gắn kết với nhau. Khi primer và khuôn bắt cặp nhau tại điểm cận dưới thì sự bắt cặp sẽ đảm bảo hơn, chứ không lỏng lẻo. Thực tế, tôi cũng phải mò mầm cái khoảng trừ này, chứ ít khi nhào vô mà được liền.
Hy vong là bạn hiểu ý tôi muốn nói cái gì.
P/S: Thân gửi ông ban weirdhobit, ông bạn không xài cái chiêu khích tướng khích tượng hay xe pháo mã gì với concầy tôi được được đâu, tôi chẳng có thời gian và lý do gì để đi giải thích tại sao tôi làm cái này mà không làm cái khác.
Concay

Chả có tướng sĩ tượng gì ở đây cả, tôi chỉ nhân tiện "phát biểu cảm nghĩ" chút xíu thôi, bác muốn hiểu sao thì tùy.
Everything has two sides or more.

Hay quá cứ có thắc mắc gửi lên y rằng có câu trả lời, tuyệt quá.
Nhưng bác concay và weirdhobbit cũng nên bắt tay nhau làm box ấm lên nhé!
Cám ơn 2 bác nhiều.
Nguyễn Thanh Hải
Không chơi nữa từ nay cắm đầu vào đọc tài liệu trên http://ttvnol.com/forum/f_257 thôi.

Mình đã đọc các bài đã post và có một số câu hỏi, mong anh chị chỉ giáo vì mình cũng đang làm đề tài tốt nghiệp về PCR!
"Dùng trong PCR những trình tự dài thì phải có nhiệt độ Tm khá cao, 61-68 oC ( so với những đoạn ngắn <65oC). Điều này sẽ giúp cho phản ứng đạc hiệu hơn."
-Tại sao nhiệt độ Tm cao thì phản ứng đặc hiệu hơn? Nếu muốn Tm cao thì do mình thiết kế mồi hay sao?
-Tại sao tăng giảm Mg2+ có thể làm giảm sản phẩm "kí sinh"?
-Thông thường thì trước khi thực hiện phản ứng PCR thì nguời ta có cần đo nồng độ của DNA mẫu hay không để tối ưu hóa như bài trên đã nói (đặc biệt là những mẫu xét nghiệm trong y tế, nếu không đạt tìh phải ly trích lại hoặc pha loãng ra vậy có mắc công quá không, còn chạy PCR luôn thì có vấn đề gì không?)
- Chỉ giúp mình những phương pháp nào làm giảm sản phẩm kí sinh và smear?

Em mạn phép trả lời, có gì không phải anh chị chỉ giúp em.
- Theo em biết, Tm được tính toán dựa trên primer sequence và phụ thuộc nhiều vào phần trăm (G+C). Công thức tính hình như đã được đề cập ở trên. Nếu cần có Tm cao, thì mình hoàn toàn có thể thiết kế primer dựa vào DNA sequence muốn tiến hành PCR. Tuy nhiên không nên dài quá (~ 20 nucleotides max) vì có thể anneal tạo sp phụ.
Em nghĩ "nhiệt độ cao" ở đây nói đến annealing temp. đúng không ạ? Ở nhiệt độ này primer sẽ anneal với DNA mẫu đã được denature (tại 94 - 95oC). Nếu nhiệt độ điều chỉnh không hợp lý, primer có thể không bind to DNA sequence, không có PCR product. Về mặt thực hành thường người ta hay tăng nhiệt độ chứ không giảm, lý do cụ thể em không được rõ nhưng rất có thể do binding capacity.
- Nồng độ DNA, theo em nghĩ, nên được đo trước. Nếu quá loãng, sp tạo thành có thể không nhìn thấy trên gel --> ko kết luận được. Trường hợp quá đậm đặc cũng sẽ khó nhìn, khó phân biệt rõ nếu sản phẩm chỉ khác biệt nhau vài bp.
Working clean sẽ tránh được sp kí sinh và smear. Một phần smear có thể do primer tạo thành.

Bạn concay và bạn weird gì đó thực sự có nghiên cứu quá chi tiết. Bravo !!!
Ở trên bạn có nói nồng độ DNA nên được tính trước. Theo mình thì không cần vì nếu có điều kiện thích hợp PCR trở nên rất sensitive, có thể dùng để clone từ một DNA duy nhất. Do đó nếu bạn lo product không đủ thì có thể cho chạy thêm nhiều vòng PCR nữa, mỗi vòng sẽ nhân gấp đôi số DNA có trong dung dịch.