PCR ???

Xin hỏi các cao thủ một chút, ta có thể tiến hành phản ứng PCR với plasmid (nguyên chứ không cắt ra rồi tiến hành PCR nhé) được không và có thể cho kết quả không ??? Có ai thử tiến hành việc này chưa xin các cao thủ chỉ giáo

Tiện thể em hỏi luôn cái !
Tris/EDTA buffer thường được dùng làm đệm hoà tan cho sp DNA sau extraction, vậy EDTA có gây ảnh hưởng cho Taq không (theo lý thuyết thì dĩ nhiên là có vì mất Mg2+, nhưng thực tế thì vẫn không sao cả !)

Dùng TE (Tris/EDTA buffer) để hoà tan DNA vì nó giúp giữ DNA lâu. Đúng là EDTA có ảnh hưởng đến PCR như cách bạn nói, nhưng nghĩ lại coi lượng DNA mà bạn bỏ vào phản ứng PCR được bao nhiêu? và trong đó thì lượng EDTA được bao nhiêu? liệu nó có đủ để làm mất Mg2+ nhiều đến mức ảnh hưởng đến PCR hông?
Vả lại theo kinh nghiệm ít ỏi của tôi thì dù nồng độ Mg2+ của bạn có chệch khỏi nồng độ chuẩn +/- 0.5mM thì PCR vẫn chạy tốt. Ngoài ra, thường TE để hoà tan DNA sau tách chiết thì nồng độ DNA khá là cao, bạn có thể pha loãng nó ra bằng nước, khi đó sự ảnh hưởng ấy còn ít hơn nữa.
Được weirdhobbit sửa chữa / chuyển vào 00:31 ngày 12/04/2004

Chạy PCR với Plasmid nguyên vẹn tôi đã từng chạy 1 lần, cho kết quả OK, nhưng sau đó tôi không làm nữa nên không có kinh nghiệm về vấn đề này. Để biết thêm chi tiết, bạn xem quyển
Methods in Molecular Biology, Vol. 226: PCR Protocols, Second E***ion, E***ed by: J. M. S. Bartlett and D. Stirling © Humana Press Inc., Totowa, NJ 2003

Nhưng phương pháp tiến hành PCR với plasmid của anh có giống với khi làm với DNA bình thường không, có sử dụng primer hay buffer đặc biệt không. Vì theo ông thầy nói thì thầy đã thử mà không được.

Thầy bạn là người VN hay người nước ngoài? Lab bạn có chuyên làm PCR không? hay chỉ "xuân thu nhị kỳ"?
PCR bản thân nó vừa là 1 nàng công chúa dịu dàng nhưng cũng là 1 mụ phù thủy gớm ghiếc. Tôi chạy PCR với genomics như cơm bữa, ấy vậy mà còn bị nó hành lên hành xuống. Vì vậy chuyện ông thầy bạn chạy PCR với plasmid có 1 lần mà đã vội kết luận là không ra thì phải coi lại; đặc biệt là phải dùng 1 positive control, từ đó mới dám nói cái negative của bạn là thật hay giả.
nếu bạn ở SG thì có thể đến HuyNguyễn để đọc tại chỗ một vài cuốn sách viết về PCR.

Xin thưa với concay@ là thầy tôi là Lê Đình Đôn phó trưởng khoa Công Nghệ Sinh Học trường Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh (tên trường nghe bèo quá phải không concay@) và đã tiến hành thí nghiệm PCR với plasmid ở đại học Kobe Nhật Bản (Lab này chắc vẫn còn bèo hỉ) thế thì đã đủ tin tưởng hay chưa hay chỉ có phòng thí nghiệm của trường ĐH KHTN và những người thuộc ĐH KHTN mới đủ sức tiến hành thành công nhỉ. Thầy tôi có nói là sách người ta viết là làm đựơc nhưng bản thân thầy đả từng thử nhưng không thành công và thầy không hề nói là không làm được mà chỉ nói là khó thực hiện mà thôi. Nhưng theo tôi thì nó sẽ thành công vì vậy tôi mới lên diễn đàn hỏi. Nhưng không ngờ không những không nhận được một lời góp ý có tính xây dựng mà ngược lại là một nghi ngờ có tính mỉa mai. Tôi chưa hề nói là thầy tôi tiến hành PCR chỉ một lần mà vội kết luận mà đó chỉ là do concay@ tự suy đóan ra mà thôi. Người mới chỉ tiến hành PCR với plasmid một lần chính là concay@ đây chứ, vậy thì ai là người hồ đồ ở đây nhỉ ??? --->> không tin thì cứ đọc kĩ những bài post ở trên đi. Tôi biết concay@ là một sinh viên khóa 1999 trường ĐH KHTN (nếu tôi nhớ không lầm là khóa đầu tiên của CNSH ĐHKHTN) nhưng mong nhận được sự giúp đỡ có tính xây dựng của nhưng đàn anh đi trước khi mà số người trong lĩnh vực CNSH chưa có nhiều, nhưng hình như tôi phải thất vọng rồi. Nếu cứ kiểu góp ý này chắc tôi nghĩ thời gian tới sẽ chỉ còn PTL Huy Nguyễn độc diễn quảng cáo mà thôi (bây giờ đã gần như vậy rồi)
Được dolly sửa chữa / chuyển vào 21:59 ngày 14/04/2004

Bravo !!!! Lần đầu tiên mới nghe có người chửi bác con cầy vuốt mặt không kịp thế đấy (dù rằng bác ấy nói chuyện với bạn còn nhẹ nhàng hơn khối lần nói chuyện với người khác rồi đấy !!)... he he he .... nghe mát lòng mát dạ dễ sợ !! Vote cho 5* đấy !!!
Nhưng mà ông con cầy này già rồi, không phải khoá 99CNSH đâu, già hơn nhiều, đừng nói thế làm ... nhóm khoá 99 tủi thân lắm !!!

Hehe, đúng là nhầm lẫn to... ông Concay mà là khoá 99 thì mang tiếng cho tụi này làm, khóa 99 ai cũng dễ thương hết, không có người quái dị như ông concay này đâu bạn à.
Chắc bạn đã đọc nhiều bài của Concay trên diễn đàn này rồi, mà sao bạn vẫn như bao người khác không hề rút được kinh nghiệm... bài của bác concay luôn có hai luồng thông tin đi song song... một luồng thông tin khoa học chính xác, bổ ích, xài được, còn một luồng là thông tin đả kích để nắn gân người khác... giống như cao thủ tung hư chiêu để làm lóa mắt đối phương vậy. Bạn muốn tìm thông tin gì thì cứ để ý tới phần đó thôi, hơi đâu ngồi ngó ba cái hư chiêu của ổng chi cho mệt, lấy tĩnh chế động, lấy vô chiêu thắng hữu chiêu. Bạn mà cứ chú ý vô ba cái trò cà khịa của concay thì rốt cuộc bạn chỉ mang một cục tức tổ bố mà chả thu được lợi ích gì.
Chúc bạn may mắn trong lần sau

Bạn Dolly thân mến , thực ra tôi rất muốn trả lời câu hỏi của bạn sớm hơn nhưng tôi lại không hiểu rõ câu hỏi nên không trả lời được. Tôi đọc đi đọc lại nhiều lần câu hỏi của bạn mà không hiểu rõ lắm. Bạn ghi thế này có thể tiến hành phản ứng PCR với plasmid (nguyên chứ không cắt ra rồi tiến hành PCR nhé) được không và có thể cho kết quả không. Ý bạn là sao nhỉ? Tiến hành phản ứng PCR với plasmid tức là bạn chạy PCR với plasmid là DNA bản mẫu, chuyện này thì đâu có gì lạ? Cho nên tôi mới thắc mắc ở đây - khuếch đại một phần nào đó của plasmid hay khuếch đại nguyên cả plasmid? Và ý bạn là khuếch đại xong rồi sẽ cho ra một plasmid mạch vòng luôn hay sao? Thú thật là tôi không rõ lắm nên tôi trả lời theo cả hai hướng.


Nếu chỉ khuếch đại một phần nào đó của plasmid (ví dụ đoạn gen sau khi insert chẳng hạn) thì chuyện này bình thường (và tôi đoán ý của bạn cũng không phải là thắc mắc về vấn đề này). Vì chuyện này nó bình thường quá rồi, nó cũng y như bạn làm PCR với DNA genome vậy thôi.

Nếu khuếch đại nguyên plasmid thì câu trả lời là được, nhưng kết quả sẽ cho ra một plasmid bị nick chứ không phải là một plasmid nguyên dạng vòng được. Phương pháp này được dùng trong tạo đột biến điểm có định hướng. Sản phẩm PCR là plasmid bị nick sau đó sẽ được biến nạp vào tế bào vi khuẩn, tế bào vi khuẩn sẽ sửa chữa chỗ bị nick này. Bạn có thể vào tham khảo sản phẩm của Stratagene ?" Cat 200518 để biết thêm nguyên tắc.
Đối với trường hợp thứ 2 trên đây, đòi hỏi bạn phải dùng một loại polymerase có độ tin cậy cao, và ?ochạy tốt? trên quãng đường dài của plasmid. Không thể dùng Taq là đương nhiên rồi. Enzyme có độ tin cậy cao nhất hiện nay là Pfu, nhưng Pfu cũng chỉ khuếch đại một đoạn DNA có kích thước tối đa là 4kb. Trường hợp plasmid của bạn >4kb thì sao? Bởi vậy Stratagen mới cho ra loại PfuTurbo DNA polymerase có khả năng khuếch đại genomic DNA lên tới 10 kb và plasmid DNA lên tới 15kb. Bản chất của nó cũng chính là Pfu đấy, nhưng có cải tiến lên nhiều nên được tin tưởng dùng trong việc tạo đột biến điểm
Đấy là về enzyme, cái cực kỳ quan trọng nữa là primer. Để tiến hành được phản ứng này thì cặp mồi được thiết kế hoàn toàn bổ sung với nhau. Plasmid là mạch vòng đúng không? Vậy thì có phải hai đầu (nếu có) của nó hoàn toàn overlap với nhau không. Cho nên primer được thiết kế hoàn toàn bổ sung cho nhau là vì vậy. Trong trường hợp này không có gì phải đắn đo trong khi bạn thiết kế mồi cả, bạn mà thử chạy bằng các phần mềm tính toán mồi chắc nó cũng báo lỗi inh ỏi vì primer dimmer quá. Nhưng mặc kệ nó đi.  
Chính vì mồi đặc biệt như vậy nên trong trường hợp này bạn cũng phải dùng lượng mồi thật nhiều, 100ng/ml. Và thời gian của giai đoạn extension cũng kéo rất dài, thường là trên 10 phút. Nhưng bù lại thì số chu kỳ cũng giảm đi, chỉ chừng 20 là maximum.  
Những ý kiến trên đây đều từ việc sử dụng Pfu Turbo để phục vụ cho việc tạo đột biến điểm trong thí nghiệm của tôi. Xin lỗi nếu tôi có nói lạc sang chủ đề tạo đột biến điểm. Bạn có thể tham khảo tại trang web của Stratagen về bộ kit tạo đột biến điểm http://www.stratagene.com/manuals/200518.pdf 
Hy vọng là câu trả lời đúng ý bạn hỏi.
Còn về chuyện bạn trách anh Con cầy, bỏ qua đi bạn, chúng ta vào đây để học hỏi mà. Không nói đến chuyện ấy nữa, chứ không thì topic lại đi sai hướng mất.
 
 
 
 
Được ginko sửa chữa / chuyển vào 00:33 ngày 15/04/2004