SAGE (serial analysis of gene expression) KỸ THUẬT MỚI TRONG PHÂN TÍCH DI TRUYỀN

SAGE (serial analysis of gene expression) KỸ THUẬT MỚI TRONG PHÂN TÍCH DI TRUYỀN

SAGE (serial analysis of gene expression) : KỸ THUẬT MỚI TRONG PHÂN TÍCH DI TRUYỀN

Tế bào đã biệt hóa không sử dụng tất cả gen của nó. Tế bào người chứa khoảng 60.000 gene, nhưng chỉ khoảng 20% số này có thể hoạt động vào một thời điểm nhất định cần thiết cho hoạt động sống của nó. Khi một yếu tố nào đó trong môi trường thay đổi, hay tế bào cần thay đổi hình thái, tập tính của nó, hoặc khi tế bào bị vi khuẩn hay virus xâm nhiễm, khi đó một số gene nhất định sẽ được kích hoạt tắt hoặc mở tùy theo yêu cầu. Câu hỏi đặt ra là có bao nhiêu gene đặc hiệu tham gia sản xuất mRNA, nghĩa là làm giảm hay tăng số lượng mRNA trong tế bào.

Chỉ cần một ảnh hưởng đơn giản bên trong hay bên ngoài tế bào là có thể làm biến đổi hoạt động của nhiều gene và các nhà nghiên cứu muốn tìm hiểu toàn bộ hệ thống tương tác giữa các phân tử sinh học trong tế bào. Nếu họ có thể ?ođọc những chương trình sinh học?o như vậy, họ sẽ có nhiều cơ hội hơn để hiểu rõ tường tận các cách thức điều hòa hoạt động gene trong chu trình sống của tế bào: làm thế nào tế bào bị ung thư, chúng đã phản ứng lại với các tác nhân xâm nhiễm như thế nào, ?

SAGE là một công cụ mới được Velculescu V.E. và cộng sự trường Đại học Johns Hopkins, Hoa Kỳ phát minh đầu tiên năm 1995, trãi qua nhiều lần hiệu chỉnh biến đổi, phiên bản của kỷ thuật SAGE ngày nay đã được thương mại hóa qua bản quyền của công ty sinh học INVITROGEN. Với kỹ thuật SAGE, từ đây cho những nhà khoa học có mộ cái nhìn tổng quát về sự hoạt động của các phức hợp gene. Công việc này, nói giản đơn, là thông qua việc bẫy các phân tử mRNA, xác định và đếm chúng. Bằng cách so sánh các dạng tế bào khác nhau, các nhà nghiên cứu hy vọng sẽ tạo ra một cơ sở dữ liệu giúp họ hiểu được tế bào khoẻ mạnh và cái gì đã xảy ra khiến tế bào bị bệnh, hoạt động bất thường.

Mỗi dạng mRNA có thành phần hóa học duy nhất mà nó được xác định và phiên mã từ những thông tính tích trữ trong một gene đặc hiệu nào đó. Khi việc giải trình tự một gene nào đó vẫn còn là một công việc phức tạp cũng như việc đọc từng mRNA có thể khiến người ta mất đến vài năm đến chục năm, và ở đây, rõ ràng là các nhà khoa học không cần đọc tòan bộ trình tự của mRNA hay gene của nó. Velculescu và cộng sự đã phát hiện rằng ?ochỉ cần 14 ký tự?o là đủ nhận diện một mRNA và xác định được gene nào đã sản sinh ra nó. Điều này quá dễ dàng và đủ độ tin cậy để đọc một phân tử RNA hơn là chúng ta đọc toàn bộ phân tử đó, nên nhớ một phân tử RNA dài trung bình là 1,9 kb.

Công việc của SAGE đó là bẫy các phân tử mRNA, dịch chúng trở lại thành cDNA, cắt thành những đoạn đuôi nhỏ 14 ký tự (gọi là tag). Ở đây, phải chú ý là chúng ta phải mất khá nhiều thời gian để đưa hàng ngàn đến chục ngàn các đoạn đuôi nhỏ lên máy đọc trình tự, do vậy, để tiết kiệm thời gian, người ta sẽ nối các đoạn đuôi đó lại với nhau, để tạo ra cái gọi là concatemer (như là một polymer, nhưng các đơn phân tử trong chuỗi là hoàn toàn khác nhau). Máy đọc trình tự sẽ đọc các concatemer, đếm có bao nhiêu đơn phân và các đơn phân này lặp lại bao nhiêu lần trong concatemer.

Các bước cơ bản của SAGE:

1. bẫy các mRNA với các hạt bead từ tính.
2. chuyển các mRNA thành cDNA.
3. cắt các cDNA tạo thành những đoạn so le
4. gắn các cDNA đã bị cắt vào các khớp nối (linker module)
5. kết hợp 2 đoạn đuôi ngắn thành một cặp đuôi hay bộ đôi (di-tags)
6. khuyếch đại cặp đuôi này bằng kỹ thuật PCR
7. loại bỏ các khớp nối và gắn các cặp đuôi thành các concatarmer
8. chuyển các concatamer vào E.coli để nhân dòng
9. chọn các đoạn concatamer tốt nhất vày giải trình tự chúng
10. sử dụng phần mềm tương thích để đọc, có bao nhiêu đoạn đuôi tag (cDNA) hiện diện trong concatarmer và tần xuất lặp lại của chúng.
11. xác định gene tương ứng đã mã hóa cho mRNA.


CONCAY

Được ! tiếp tục cố gắng