Xin cac huynh de chi giao: Lam the nao de thiet ke primer cho chay PCR ma khong chua Taq?

Xin cac huynh de chi giao: Lam the nao de thiet ke primer cho chay PCR ma khong chua Taq?

That su toi ko hieu ban hoi gi, ban co the giai thich chi tiet hon cau hoi cua ban duoc ko?

Toi can san pham PCR de chay tren Wave machine tim polymophism va mutation nhung neu san pham PCR ma co chua chuoi Taq hay M13 thi may khong nhan duoc ma chi co the check tren sequencing machine thoi. Y toi muon hoi la co ban nao biet chuoi sequence cua Taq hay M13 hay khong?

Tôi đúng là chưa thể hiểu được bạn muốn hỏi gì? nhưng với vấn đề của bạn, chẳng phải cái wave machine đó nó có recommendation làm sao để xử lý mẫu để loại những thứ đó sao??? Tôi chưa từng đụng tới cái wave machine bao giờ, nhưng có nghe loáng thoáng đồng nghiệp bàn gì đó về chuyện là PCR cho nó chỉ xài được Hot Start ApmpliTaq Gold mà thôi hình như cũng vì lý do gì đó mà xài các Taq khác thì máy đọc không được. Ngoài ra, chị ấy còn xài hỗn hợp Pfu và AmpliTaq Gold (1:9 thì phải) để hạn chế trường hợp point mutation là do Taq tổng hợp bị lỗi.

Wave machine hay dHPLC(denaturing hịgh performance liquid chromatography), may nay dung de check polymophism and mutation frequency voi so luong mau lon.

cox đọc hoài mà cũng chưa hiểu bạn muốn hỏi gì, nếu bạn muốn run SSCP cox nhớ cách đây hơn 10 năm thì cox còn phải run on gel cả mười mấy tiếng, time consuming . Nhưng bây giờ có transgenomic wave technology thì khỏe rồi, nhưng dù gì reaction vẫn phải dùng Pfu or Tag, cox đoán là bạn muốn hỏi run the reaction without using Tag . Nhưng nếu use Pfu thì primer design cũng giống như use Tag thôi . Thường thì cox nhắm mà design theo kinh nghiệm của mình, nhưng nếu bạn muốn, bạn có thể dùng GCG v8 primer program or WI 3 primer program trong http://www.genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3_www.cgi. Bạn chỉ nên amplify fragments dài khoảng 187 - 297 base pairs thôi . Nếu mà melting temperatures của primers cách nhau hơn 4 degree thì bạn nên modify your primers bằng cách thêm GC ( từ 4-10 base pairs) . The last base of primers was backed up from the intron-exon boundery by 19-85bp on the 5'' side, and 6-58 bp on the 3'' side.

Thank Cox lam lam, toi co the design Primer duoc roi. Hi vong se OK vao ngay mai.

A hoi Cox cau hoi nua duoc khong, ban co biet khi nao thi dung duoc BigDye Primer Cycle sequencing ready kit va BigDye Teminator Cycle sequencing kit khong. Toi khong biet su khac nhau giua hai kit nay nen khong the order duoc. Ban giup toi nhe.

Hi coi, how was your PCR? did it work with your primers?
Để trả lời câu bạn hỏi with the dye terminator labeling thì each of the dideoxy terminators (ddNTPs) được label với flourescent dye khác nhau . Còn with dye primer labeling thì primers được tag with flourescent dye . Dye primer chemistries produce more signal intensitives than dye terminator chemistries . Thường thường người ta có sẵn những common dye primers như T7, SP6, M13.....
Hope that helps .
cox

Thank you very much. I got the primer yesterday so now I am preparing for optimization new primers. Hopefully they work!!!!!! Do you know something about PCR protocol for Pyrosequencing. Is it special or normal one?. Thank you again for your help. Have a nice weekend, everybody.